[發明專利]一種基于微流控芯片的農藥殘留檢測方法

在審

• 申請號: 201710583219.2
• 申請日: 2017-07-18
• 公開（公告）號: CN109270280A
• 公開（公告）日: 2019-01-25
• 發明（設計）人: 呂朝妮
• 申請（專利權）人: 呂朝妮
• 主分類號: G01N35/00
• 分類號: G01N35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于微流控芯片的農藥殘留檢測方法，其特征在于，該傳感器的組裝過程為：將蛋白A通入微流控芯片中，蛋白A和金原子緊密結合，且與農藥抗體的Fc端結合而使其定向固定；再將毒死蜱抗體通入微流控芯片中；最后，利用抗原抗體間的特異性反應，通入不同濃度的農藥，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗后進行阻抗檢測，進而制備出了一種新型的農藥殘留免疫傳感器；根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述農藥分子為毒死蜱農藥。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，使用的微流控芯片由一塊一面濺射有三對插指金電極的玻璃平板和另一塊具有微通道構型的玻璃封接平板疊合而成；叉指電極的兩端由兩根引線引出，兩個平板中間形成封閉通道,在其中一塊平板上設置有通道的進出口，微流體通道(深40μm，寬100μm)與微流體檢測室(寬500μm，長1723μm；容積為34.5nL)由聚二甲基硅氧烷(PDMS)模設計而成，金插指電極由3對陣列電極組成,相互交叉在一起。

3.根據權利要求1所述方法，其特征在于，抗體在微流控芯片上的固定步驟如下：

1)清洗并測試微流控芯片；

2)將步驟1)所得微流控芯片進行流量、外加電壓、液體通入時間等參數，進行優化；

3)將步驟2)所得的微流控芯片中，在最優條件下通入蛋白A，獲得蛋白A修飾界面；

4)在步驟3)所得蛋白A修飾芯片中通入抗體，獲得抗體修飾界面；根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟1)所述清洗并測試微流控芯片，是分別通入一定量的氫氧化鈉、氯化氫等一段時間，再通入雙蒸水，沖洗干凈；最終，經超純水沖洗后，進行阻抗譜掃描，與上次裸電極的結果對比，兩者基本重合，則說明清洗干凈，否則需要重新清洗。

4.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟2)所述流量、外加電壓等參數進行了優化：流量選取在5-35μL/min；外加電壓選取在10-100mV；液體通入時間1-10min。

5.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟3)所述通入蛋白A溶液，通入的流量為10μL/min，固定90min。

6.根據權利要求2所述方法，其特征在于，步驟4)所述通入毒死蜱抗體，通入的流量為10μL/min，固定2h，孵育溫度為4℃。

7.根據權利要求2所述方法，其特征在于，檢測方法建立具體步驟如下：

1)微流控芯片的清洗：首先通入0.1M氫氧化鈉，靜止1h，通入雙蒸水30min，沖洗干凈；再通入0.1M氯化氫，靜止1h，通入雙蒸水30min，沖洗干凈；整個試驗清洗中的通速都采用10μL/min；最終，經超純水沖洗后，進行阻抗譜掃描，與上次裸電極的結果對比，兩者基本重合，則說明清洗干凈，否則需要重新清洗，如有需要，可以通過顯微鏡觀察微流控中金插指微陣列電極的表面狀態，(清洗過程與乙醇、丙酮等方法進行對比清洗效果，選出了適當的清洗方法)；

2)取蛋白A原液(1mg/mL)，用PBS稀釋不同倍數，配置10、100、200μg/mL等不同濃度，對其阻抗值進行測定，篩選出試驗所用最佳的濃度值，通入蛋白A溶液的流量為10μL/min，固定90min；

3)取毒死蜱抗體原液(1mg/mL)，用PBS稀釋不同倍數，配置10、100、200μg/mL等不同濃度，對其阻抗值進行測定，篩選出試驗所用最佳的濃度值100μg/mL，通入毒死蜱抗體的流量為10μL/min，固定2h，孵育溫度為4C；

4)通入不同濃度的毒死蜱農藥，通入的流量為10μL/min，用PBS沖洗后進行阻抗檢測，建立毒死蜱濃度與阻抗變化之間的標準曲線，在1-1.0 104ng/mL范圍內線性范圍良好，線性回歸方程分別為：y＝65.580lgC(ng/mL)+9.8400(線性相關系數R2＝0.9868)。

8.根據權利要求1所述方法，果蔬中農藥殘留具體檢測步驟如下：

1)果蔬樣品預處理方法如下：選取蔬菜或水果樣品，用潮濕的抹布將蔬菜表面的泥土擦拭干凈，切碎成3 3mm，取樣品2g，放入提取瓶中，加入10mL磷酸鹽緩沖液，放入超聲提取儀，超聲提取3min，倒出提取液靜置2min，備用；

2)在微流控芯片上固定抗體后，用PBS沖洗10min后進行阻抗檢測，利用得到的阻抗圖譜中的bode圖，獲取所測阻抗值Z1；

3)加入果蔬樣品液后，微流控芯片用PBS沖洗10min后進行阻抗檢測，利用得到的阻抗圖譜中的bode圖，獲取所測阻抗值Z2；

4)計算農藥測試前后的阻抗變化ΔZ＝Z2-Z1，根據阻抗變化與毒死蜱濃度的關系曲線獲得果蔬實際樣品農藥濃度的信息。