[發明專利]一種建立菜心懸浮細胞系的培養方法

有效

• 申請號: 201710583067.6
• 申請日: 2017-07-17
• 公開（公告）號: CN107494261B
• 公開（公告）日: 2019-10-15
• 發明（設計）人: 莫測輝;趙海明;杜歡;蔡全英;李彥文;李慧
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12N5/02
• 分類號: C12N5/02;A01H4/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 單香杰

1.一種建立菜心懸浮細胞系的培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.胚性愈傷組織的誘導：將無菌苗下胚軸外植體接入初代愈傷組織誘導培養基中進行愈傷組織誘導，所述初代愈傷組織誘導培養基的配方為：MS+0.5～3 mg/L毒莠定+1 mg/L6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L結冷膠，培養基pH為5.8；

S2.將步驟S1獲得的愈傷組織先后接入繼代培養基A和繼代培養基B中進行多次反復交替繼代培養，所述繼代培養基A的配方為：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+3g/L結冷膠+400 mg/L水解酪蛋白，培養基pH為5.8；所述繼代培養基B的配方為：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L結冷膠+400 mg/L水解酪蛋白+1 mg/L ABA；

S3.菜心懸浮細胞系的建立：將步驟S2獲得的胚性愈傷組織接入液體繼代培養基C中進行繼代培養，最終獲得均勻的懸浮細胞液，所述液體繼代培養基C的配方為：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+400 mg/L水解酪蛋白，培養基pH為5.8。

2.根據權利要求1所述菜心懸浮細胞系的培養方法，其特征在于，步驟S1中所述初代愈傷組織誘導培養基的配方為：MS+1.5 mg/L毒莠定+1 mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+3 g/L結冷膠，培養基pH為5.8。

3.根據權利要求1所述菜心懸浮細胞系的培養方法，其特征在于，步驟S1中所述胚性愈傷組織的誘導條件為25℃、光照時間16h光照/8h黑暗、光照強度1600～2000 lux。

4.根據權利要求1所述菜心懸浮細胞系的培養方法，其特征在于，步驟S2中所述繼代培養基A和B的培養條件均為25℃、黑暗條件下培養15 d。

5.根據權利要求1所述菜心懸浮細胞系的培養方法，其特征在于，步驟S3中所述繼代培養的過程為：將淡黃色胚性愈傷組織按1 g/50 mL的接種量接入液體繼代培養基C中振蕩培養1周后，用網篩過濾掉大的細胞團，濾液離心后去掉上清液，將沉淀細胞接入新鮮液體繼代培養基C中繼代培養1周，紗網過濾后收集濾液；之后每7 d繼代培養一次，將懸浮細胞沉降片刻后倒去一半上清液，補充新鮮液體繼代培養基C至50 mL繼續懸浮培養；每2周將細胞過多的懸浮細胞分瓶；每4周用紗網過濾懸浮細胞，保留濾液，最終獲得均勻的懸浮細胞液。

6.根據權利要求5所述菜心懸浮細胞系的培養方法，其特征在于，步驟S3中所述振蕩培養條件為25℃、散射光、轉速140 r/min。

7.根據權利要求5所述菜心懸浮細胞系的培養方法，其特征在于，步驟S3中所述離心條件為4℃、轉速3500 r/min、離心10 min。

8.根據權利要求5所述菜心懸浮細胞系的培養方法，其特征在于，步驟S3中所述網篩孔徑為40目，所述紗網孔徑為100目。