[發明專利]一株分泌抗丁香酚單克隆抗體的雜交瘤細胞株CS12及其應用

有效

• 申請號: 201710580921.3
• 申請日: 2017-07-17
• 公開（公告）號: CN107189988B
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 胥傳來;陳燕妮;匡華;徐麗廣;劉麗強;宋珊珊;吳曉玲;胡擁明
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/44;G01N33/577;G01N33/94
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

技術領域

本發明涉及一株分泌抗丁香酚單克隆抗體的雜交瘤細胞株CS12及其應用，可用于魚肉中丁香酚殘留的檢測，屬于食品安全免疫檢測技術領域。

背景技術

丁香酚類化合物，主要包括丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、甲基異丁香酚、乙?；惗∠惴拥?，其主要官能團為與苯環相連的酚羥基、烯丙基以及一個甲氧基及其衍生物，具有麻醉、抑菌、抗氧化等多種藥理作用。然而其在漁用麻醉運輸方面較其他的麻醉劑具有成本低、效果好以及殘留期短的特點，近幾年各國都有將其應用于漁業生產與活鮮水產品流通運輸領域的報道。而美國國家毒理學計劃（NTP）發布的毒理學數據顯示，丁香酚類化合物（包括丁香油、丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚）對嚙齒動物是致癌物或潛在的致癌物。

因此，其安全性值得懷疑。雖然有些國家如澳大利亞、新西蘭、智利等將丁香酚類化合物列為沒有殘留期的合法水產麻醉劑應用于親魚采卵、活魚運輸以及手術過程的麻醉，但都嚴格規定了其休藥期和殘留量。而我國，至今并沒有相關部門正式審批丁香酚類漁用麻醉劑應用于水產品中的規定。因此，急需建立水產品中丁香酚類化合物的快速檢測方法。

目前，國內外報道的丁香酚化合物檢測主要是通過高效液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜串聯質譜、TLC 法和毛細管電泳法等。但這些方法的樣品前處理過程復雜，實驗周期長，不適合大量樣本的快速檢測。酶聯免疫分析方法（ELISA）是一種半定量的、簡單、靈敏、快捷和高通量的檢測方法，對于食品中藥物殘留的檢測有重要意義。但目前沒有抗丁香酚單克隆抗體制備的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一株分泌抗丁香酚單克隆抗體的雜交瘤細胞株CS12及其應用，由該細胞株制備的抗體對丁香酚具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立ELISA方法。

本發明內容包括兩個方面，單克隆抗體的制備和其應用?？苟∠惴訂慰寺】贵w是通過小鼠免疫丁香酚免疫原獲得。免疫原和包被原都是由丁香酚的結構類似物阿魏酸通過活潑酯法合成。篩選血清陽性高抑制好的小鼠取脾臟，將脾細胞與Sp2/0瘤細胞融合。融合后用間接ELISA方法檢測細胞上清，篩選對陽性高且對丁香酚抑制好的細胞進行亞克隆，進行三次亞克隆，獲得純的細胞株。將細胞株注射進打過石蠟油的小鼠的腹腔制備腹水，獲得的腹水用辛酸-硫酸銨方法進行純化。測定單克隆抗體對丁香酚的半數抑制濃度(IC₅₀)，以及對其結構類似物的IC₅₀，計算交叉反應率。將丁香酚藥物添加入魚肉中，進行樣本添加回收實驗，計算回收率。

本發明的技術方案：一株分泌抗丁香酚單克隆抗體的雜交瘤細胞株CS12，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No.13085，保藏日期為2016年10月31日，分類命名單克隆細胞株。

抗丁香酚單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCC No.13085的雜交瘤細胞株CS12分泌產生。

所述抗丁香酚單克隆抗體的應用，用于魚肉中丁香酚殘留的檢測。

本發明的有益效果：本發明采用間接競爭ELISA測定細胞株CS12分泌的單克隆抗體，對丁香酚的IC₅₀為1.28 μg/mL。對魚肉中丁香酚的回收率范圍為96.8%～115.6%。為魚肉中丁香酚殘留的免疫檢測提供了原料，具有實際應用價值。

生物材料樣品保藏：一株分泌抗丁香酚單克隆抗體的雜交瘤細胞株CS12，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No.13085，保藏日期2016年10月31日，分類命名為單克隆細胞株。

附圖說明

圖1 CS12分泌的單克隆抗體對丁香酚的標準抑制曲線。

具體實施方式

本發明下面的實施例僅作為本發明內容的進一步說明，不能作為本發明的限定內容或范圍。下面通過實施例對本發明作進一步說明。

實施例1 免疫原和包被原合成