[發(fā)明專利]重組Wzt蛋白兔血清多克隆抗體及其制備方法

在審

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• 申請日: 2017-07-17
• 公開（公告）號: CN107236039A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王秀然;王浩;盧天成;王巖;李海燕;付玉芹;孫喆;李思圓;賈宇;王茗宇;劉思陽;胡祥坤;邊紅;李全亮
• 申請（專利權(quán)）人: 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K16/12
• 分類號: C07K16/12;C07K16/06;C12N15/70;C12N15/31;C12N15/66;C07K14/23;C07K1/22
• 代理公司: 長春菁華專利商標(biāo)代理事務(wù)所(普通合伙)22210
• 代理人: 陶尊新

1.重組Wzt蛋白兔血清多克隆抗體，其特征在于，它是利用重組Wzt蛋白作為抗原，對雌性家兔進(jìn)行四次免疫后再經(jīng)純化處理后獲得的。

2.制備權(quán)利要求1所述的重組Wzt蛋白兔血清多克隆抗體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、初次免疫

將500μg重組Wzt蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化后，在雌性家兔背部進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)100μg重組Wzt蛋白；

步驟二、二次免疫

在初次免疫的一周后進(jìn)行二次免疫，將400μg重組Wzt蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化后，在雌性家兔背部進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)80μg重組Wzt蛋白；

步驟三、三次免疫

在二次免疫的一周后進(jìn)行二次免疫，將400μg重組Wzt蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化后，在雌性家兔背部進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)80μg重組Wzt蛋白；

步驟四、四次免疫

在三次免疫的一周后進(jìn)行二次免疫，將400μg重組Wzt蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑混合乳化后，在雌性家兔背部進(jìn)行皮下多點(diǎn)注射，每點(diǎn)80μg重組Wzt蛋白；

步驟五、每次免疫后采集雌性家兔耳靜脈血，以未進(jìn)行免疫時的兔血清為對照、純化后重組Wzt蛋白為抗原，應(yīng)用間接ELISA法檢測兔血清抗體效價(jià)，血清稀釋倍數(shù)分別為100、200、400、1600、3200、6400；

步驟六、第四次免疫一周后，采集兔全血，將收集的兔全血在37℃靜置2h，4℃靜置過夜，次日4000rpm、離心10min收集上清，得到兔血清；

步驟七、純化

(1)將上述所得兔血清與等體積的抗體結(jié)合緩沖液混合后過濾；

(2)用10倍柱體積的抗體結(jié)合緩沖液平衡ProteinA柱子，將上述過濾后的兔血清打入到柱子中；

(3)用抗體結(jié)合緩沖液清洗柱子，洗脫雜蛋白，直至流出的下液中不含有蛋白成分；

(4)用抗體洗脫液過柱，洗脫抗體，收集流出的下液，并用pH9.0的Tris-HCl調(diào)節(jié)pH至中性，收集重組Wzt蛋白兔血清多克隆抗體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組Wzt蛋白兔血清多克隆抗體的制備方法，其特征在于，所述重組Wzt蛋白采用以下方法制備：

步驟一、構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD-19T-wzt

(1)對GenBank中記錄的wzt基因序列進(jìn)行優(yōu)化處理，將目的基因片段與克隆載體pMD-19T(Simple)連接，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD-19T-wzt；

(2)對重組克隆質(zhì)粒pMD-19T-wzt進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理；

(3)對轉(zhuǎn)化后的重組克隆質(zhì)粒pMD-19T-wzt進(jìn)行提??；

(4)采用PCR、雙酶切、測序?qū)χ亟M克隆質(zhì)粒pMD-19T-wzt進(jìn)行鑒定；

步驟二、構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-21b-wzt

(1)挑選測序結(jié)果正確的重組克隆質(zhì)粒pMD-19T-wzt進(jìn)行NdeI和XhoI雙酶切、凝膠回收后得到目的基因片段，目的基因片段與克隆載體pET-21b用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，4℃過夜孵育，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-21b-wzt；

(2)對重組表達(dá)載體pET-21b-wzt進(jìn)行轉(zhuǎn)化；

(3)對轉(zhuǎn)化后的重組表達(dá)載體pET-21b-wzt進(jìn)行提?。?/p>

(4)采用PCR、雙酶切對重組表達(dá)載體pET-21b-wzt進(jìn)行鑒定；

步驟三、重組Wzt蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

在菌液OD₆₀₀＝1時，加入終濃度為lmM的IPTG，33℃誘導(dǎo)14h后，獲得含有重組Wzt蛋白的菌液，Wzt蛋白分子量為27kDa；

步驟四、目的蛋白的純化

收集誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體，超聲破碎后，在4℃、12000rpm離心45min，過濾上清，用HisTrapFF親和層析柱純化目的蛋白，依次經(jīng)洗脫、洗滌、平衡、上蛋白、洗脫雜蛋白、洗脫目的蛋白后得到純化的重組Wzt蛋白，純化后重組Wzt蛋白的純度為93％，回收率為2％；對純化的重組Wzt蛋白進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析；

步驟五、純化后重組Wzt蛋白的N端測序鑒定

采用基于Edman降解法的N端序列分析方法對純化后重組Wzt蛋白進(jìn)行N端分析，測得純化后重組Wzt蛋白N端序列為：

NH₂-Met-Ile-Gln-Pro-Ser-Ile-Thr-Leu-Ser-Asn，與目標(biāo)蛋白N端序列一致。