[發(fā)明專(zhuān)利]一種新型新生兒敗血癥快速檢測(cè)試劑盒

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710579225.0
• 申請(qǐng)日: 2017-07-19
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107217000A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 云南仁橋醫(yī)療科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12M1/34
• 分類(lèi)號(hào): C12M1/34;C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種新型新生兒敗血檢快速檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)

新生兒敗血癥是新生兒常見(jiàn)疾病之一，指新生兒期致病菌經(jīng)各種途徑侵入其血循環(huán)系統(tǒng)，并在其中生長(zhǎng)繁殖、產(chǎn)生毒素，最終造成全身性的炎癥反應(yīng)。該病的病因較復(fù)雜，常見(jiàn)致病菌有大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄菌、克雷白桿菌及B組鏈球菌等，主要通過(guò)宮內(nèi)感染、產(chǎn)時(shí)感染及產(chǎn)后感染。新生兒敗血癥是新生兒常見(jiàn)的全身性疑團(tuán)莫釋感染疾病。

新生兒時(shí)期該病的發(fā)生率和病死率均較高，常常會(huì)危及到新生兒的生命，嚴(yán)重者可并發(fā)化膿性腦膜炎并遺留中樞神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，但因缺乏典型的臨床表現(xiàn)和體征，往往病情進(jìn)展迅速，嚴(yán)重威脅新生兒的生命。由新生兒敗血癥引起的指新生兒期病原菌進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)并進(jìn)行繁殖釋放毒素進(jìn)而導(dǎo)致全身性感染，是導(dǎo)致新生兒死亡的重要原因之一，其發(fā)生率為0。1％至1.0％，在早產(chǎn)兒中發(fā)生率更高，病死率高達(dá)10％至50％，因此做好早期診斷具有重要意義。

目前，臨床上的血培養(yǎng)檢測(cè)細(xì)菌常用方法由于檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，且陽(yáng)性率較低，難以達(dá)到早期診斷的目的。例如，作為目前新生兒敗血癥有主要診斷手?jǐn)嗟募?xì)菌培養(yǎng)，受細(xì)菌培養(yǎng)周期的影響，其相關(guān)診斷結(jié)果需要在培養(yǎng)后72小時(shí)以后才可以獲得。即便如此，由于一些相關(guān)細(xì)菌分離存在一定的困難，使得結(jié)果出現(xiàn)一定概率的假陰性，相關(guān)報(bào)告表明在確診的新生兒中有30％-40％的患兒血液培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)了假陰性情況。而臨床常用的其它非特異性指標(biāo)也存在著一定的問(wèn)題，例如CRP在感染后24小時(shí)左右才會(huì)出現(xiàn)升高的情況，而出生體重較低的嬰兒反應(yīng)更慢，白細(xì)胞計(jì)數(shù)等指標(biāo)在診斷新生兒敗癥明缺乏敏感性與特異性。

對(duì)于新生兒敗血癥的檢測(cè)與診斷，傳統(tǒng)的診斷方法存在的固有的缺點(diǎn)，例如操作周期長(zhǎng)，靈敏度低等。因此有必要建立一個(gè)快速、準(zhǔn)確的診斷方法，確保新生兒敗血癥檢測(cè)與診斷進(jìn)行快速診斷

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種新型新生兒敗血癥快速檢測(cè)試劑盒，其目的在于對(duì)新生兒敗血癥進(jìn)行快速檢測(cè)，起到早其診斷的目的，可用于臨床可疑感染患者的病原鑒別與診斷。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：通過(guò)一種熒光PCR引物、探針及試劑盒的制備對(duì)疑似患有新生兒敗血癥的患兒的血樣進(jìn)行分析、檢測(cè)，進(jìn)而起到快速診斷新生兒敗血癥的目的。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種檢測(cè)用引物及探針對(duì)新生兒敗血癥進(jìn)行檢測(cè)。

進(jìn)一步，本發(fā)明提供的用于檢測(cè)新生兒敗血癥的引物序列為SEQ ID No.1～SEQ ID No.2

進(jìn)一步，本發(fā)明提供的用于檢測(cè)新生兒敗血癥的所述探革蘭陽(yáng)性菌及陰性菌探針，所述序列分別為SEQ ID No.3和SEQ ID No.4，探針的5’端分別連接不同的報(bào)告基團(tuán)，3’端連接非發(fā)光的猝滅基團(tuán)：

優(yōu)選的，所述報(bào)告基團(tuán)為FAM,TET,JOE或HEX其中一種，淬滅基團(tuán)為T(mén)AMRA或BHQ1其中一種，所述檢測(cè)體系中還加有RT-PCR MIX及超純水。所述試劑盒還含有RT-PCR酶及陽(yáng)性對(duì)照品。

優(yōu)選的，所述陽(yáng)性對(duì)照品以革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌的目的基因片斷進(jìn)行PCR擴(kuò)增并將擴(kuò)增的目的電泳條帶回收，連接到克隆質(zhì)粒載體，測(cè)序篩選陽(yáng)性克隆，并以陽(yáng)性重組質(zhì)粒做為陽(yáng)性對(duì)照品，革蘭陽(yáng)性菌上下游引物引物序列分別為SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，革蘭陰性菌的上下游引物序列分別為SEQ ID No.7和SEQ ID No.8。

優(yōu)選的，本發(fā)明，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度，并將其最終稀釋到10⁸copies/μL。

優(yōu)選的，本發(fā)明，陰性對(duì)照管包含高溫壓滅的焦碳酸二乙脂處理水。

優(yōu)選的，本發(fā)明，試劑盒檢測(cè)體系為：熒光檢測(cè)體系混合液10μL， RT-PCR酶3.5μL，待測(cè)樣品5μL。熒光檢測(cè)體系混合液包括引物和熒光探針，其中引物濃度為100-1000nM，探針濃度為50-500nM。

優(yōu)選的，本發(fā)明所述待測(cè)樣品為樣本核酸提取液體及陽(yáng)性對(duì)照品。

本發(fā)明的PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃2min；94℃15s；60℃1min,40個(gè)循環(huán)。

本發(fā)明樣本核酸提取液來(lái)自新生兒血液。

本發(fā)明提供的熒光宣試劑盒需保存于-20℃條件下，熒光檢測(cè)體系混合液需避光保存。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于快速檢測(cè)新生兒敗血癥。本試劑盒法靈敏度高、特異性好，能夠檢測(cè)到最低濃度為10copies/μL數(shù)量級(jí)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，能夠特異性識(shí)別新生兒敗血癥并對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型。

附圖說(shuō)明