[發(fā)明專利]聯(lián)苯菊酯膠體金免疫層析試紙條及其制備和使用方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710579035.9
• 申請日: 2017-07-17
• 公開（公告）號: CN107356748A
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 馮銳;龍飛;羅莉妮;楊鵬博
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東志道醫(yī)藥科技有限公司;廣州安諾食品科學(xué)技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/543
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及對聯(lián)苯菊酯的檢測領(lǐng)域，具體涉及一種聯(lián)苯菊酯膠體金免疫層析試紙條及其制備和使用方法。

背景技術(shù)

聯(lián)苯菊酯是第三代合成擬除蟲菊酯農(nóng)藥的一種，殺蟲活性很高，主要為觸殺和胃毒作用，無內(nèi)吸和熏蒸活性，其作用迅速，持效期長，殺蟲譜廣。近年來，其被廣泛應(yīng)用于茶樹、果樹、蔬菜等農(nóng)業(yè)害蟲及白蟻等衛(wèi)生害蟲的防治。

聯(lián)苯菊酯的廣泛使用容易導(dǎo)致較大殘留，其長期被攝入人體后，會有累積作用，對人體的健康有著潛在的風險，如：它具有神經(jīng)毒害作用，通過影響動物的神經(jīng)系統(tǒng)和離子通道活性，干擾神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。因而，長期低劑量食用含有聯(lián)苯菊酯殘留的農(nóng)產(chǎn)品會對人們的健康造成嚴重危害。

目前聯(lián)苯菊酯的殘留分析方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、高效薄層色譜法等。儀器檢測方法樣品前處理繁瑣，儀器昂貴龐大，需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)、有豐富經(jīng)驗的人員操作，并且檢測費用高，不適合批量樣品的快速檢測與現(xiàn)場檢測。

免疫檢測方法具有靈敏度高、特異性強、方便快捷、操作簡單、成本低廉，無需借助昂貴的設(shè)備等優(yōu)點，特別是膠體金免疫層析試紙條的出現(xiàn)，更加適合基層部門和普通消費者使用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有檢測技術(shù)存在的缺陷，提供一種可檢測聯(lián)苯菊酯的膠體金免疫層析試紙條，可用于蔬菜和水果等產(chǎn)品中聯(lián)苯菊酯的快速檢測和初篩。

為達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種聯(lián)苯菊酯膠體金免疫層析試紙條，該試紙條包括PVC底板、樣品墊、金標墊、硝基纖維素膜及吸水墊，所述樣品墊、金標墊、硝基纖維素膜、吸水墊均設(shè)置在PVC底板的上方，所述樣品墊設(shè)置在PVC底板一側(cè)的邊緣，金標墊與樣品墊部分重疊設(shè)置；所述樣品墊和金標墊為玻璃纖維膜，金標墊上包被有膠體金標記的聯(lián)苯菊酯抗體；所述硝基纖維素膜位于PVC底板的中部并且其兩端分別與金標墊及吸水墊部分重疊；硝基纖維素膜上靠近金標墊的一端噴涂有檢測線，所述檢測線包被聯(lián)苯菊酯半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物；硝基纖維素膜上靠近吸水墊的一端噴涂有控制線；所述控制線上包被兔抗鼠或羊抗鼠IgG抗體；所述吸水墊為濾紙；所述聯(lián)苯菊酯半抗原如式Ⅰ所示。

本發(fā)明所述檢測聯(lián)苯菊酯的膠體金免疫層析試紙條的制備方法，包括以下步驟：

1.制備聯(lián)苯菊酯半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物：將聯(lián)苯菊酯半抗原通過琥珀酸酐法、六溴己酸乙酯法或一氯醋酸鈉法引入羧基，然后通過碳二亞胺法、混合酸酐法或活潑酯法與牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)進行偶聯(lián)，制備聯(lián)苯菊酯半抗原-BSA偶聯(lián)物與聯(lián)苯菊酯半抗原-OVA偶聯(lián)物；

2.制備聯(lián)苯菊酯抗體：將聯(lián)苯菊酯半抗原-BSA偶聯(lián)物多次免疫小鼠，取小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞在體外進行融合，制備雜交瘤細胞。將陽性雜交瘤細胞注入小鼠腹腔收集腹水，或以體外細胞培養(yǎng)的收集上清液的方式制備聯(lián)苯菊酯抗體；

3.制備膠體金：以檸檬酸三鈉還原法制備膠體金，膠體金顆粒直徑在20～ 40nm之間；

4.膠體金標記抗體：將膠體金溶液與聯(lián)苯菊酯抗體按1μg/mL～20μg/mL 的比例混勻，通過離心純化、濃縮，制備成膠體金標記的聯(lián)苯菊酯抗體；

5.將膠體金標記的聯(lián)苯菊酯抗體噴涂并固定在金標墊上，將聯(lián)苯菊酯半抗原-OVA偶聯(lián)物包被在檢測線上，將兔抗鼠或羊抗鼠IgG抗體包被在控制線上，并充分干燥；

6.將硝基纖維素膜、金標墊、樣品墊、吸水墊依次粘合在PVC底板上，切成條狀，即制成檢測聯(lián)苯菊酯的膠體金免疫層析試紙條。

本發(fā)明所述的檢測聯(lián)苯菊酯的膠體金免疫層析試紙條的使用方法如下：

樣品經(jīng)前處理后，用提取溶劑提取，提取溶劑為一定濃度的乙醇水溶液或磷酸鹽緩沖液或兩者混合物,，得到樣品溶液，將適量樣品溶液滴加到樣品墊上，樣品溶液將會向吸水墊端移動；待一段時間后，根據(jù)檢測線和控制線的顯色情況，判斷樣品中是否含有聯(lián)苯菊酯，判斷方法如下：

(1)檢測線顯紅色，控制線顯紅色——陰性結(jié)果，樣品中不含聯(lián)苯菊酯；

(2)檢測線不顯紅色，控制線顯紅色——陽性結(jié)果，樣品中含有聯(lián)苯菊酯；

(3)無論檢測線顯不顯紅色，控制線不顯紅色——試紙條失效。

本發(fā)明所述的檢測聯(lián)苯菊酯的膠體金免疫層析試紙條的檢測原理如下：