[發明專利]一種豬圓環病毒2型滅活疫苗的生產方法

有效

• 申請號: 201710573763.9
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN107308446B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 馬明;趙玉龍;吳雅清;焦玉蘭;朱秀同;石勇;趙麗霞
• 申請（專利權）人: 瑞普（保定）生物藥業有限公司
• 主分類號: A61K39/12
• 分類號: A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 張換君

本發明提供了一種豬圓環病毒2型滅活疫苗的生產方法，疫苗半成品毒液經澄清過濾、濃縮純化、滅活、稀釋、與雙相佐劑混合乳化，制備豬圓環病毒2型滅活疫苗，并評價疫苗質量。與現有生產工藝相比，本發明制備的疫苗副反應小、抗原含量高、疫苗質量穩定、生產成本低、疫苗免疫效果評價快速有效。

技術領域

本發明涉及一種疫苗的生產方法，尤其是一種豬圓環病毒2型滅活疫苗的生產方法，屬于生物技術領域。

背景技術

豬圓環病毒2型（PCV2）是引起斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（PMWS）的主要病原，自1991年加拿大首次報道PMWS以來，該病現已波及世界各地，在我國豬群中流行十分嚴重，臨床上常與豬高致病性繁殖與呼吸綜合征、豬口蹄疫以及豬細小病毒病等混合感染、繼發感染，給全世界養豬業造成了重大的經濟損失。

疫苗免疫接種是防控豬圓環病毒病（PCVD）的有效手段，目前商品化的豬圓環病毒疫苗均為滅活疫苗，受生產方式限制，還普遍存在著抗原含量偏低、副反應機率大和效力評價方法單一等問題，影響了疫苗應用效果。⑴抗原含量偏低： 按照生產標準PCV2疫苗半成品毒液毒價趨于10^6.0～10^7.0TCID₅₀/ml，毒液處理及滅活過程中抗原損失量大。⑵疫苗效力評價方法單一：目前PCV2滅活疫苗效力檢驗是采用仔豬或小鼠免疫攻毒法，仔豬攻毒實驗尤其存在篩選陰性實驗豬的困難，動物攻毒實驗檢測周期長（小鼠52天、仔豬45天），PCV2攻毒模型建立困難，檢驗結果批間差異大。⑶疫苗副反應機率大：由于滅活病毒液含有大量異物蛋白及滅活劑，因此仔豬和母豬免疫過程中極易出現副反應。

因此有必要開發一種新型的豬圓環病毒2型滅活疫苗的生產方法，以解決以上問題，提升疫苗質量。

發明內容

本發明的目的為提供一種豬圓環病毒2型滅活疫苗的生產方法，經PCV2病毒澄清過濾、濃縮純化、滅活、乳化及成品苗評價，生產出抗原含量高、副反應小、質量穩定的豬圓環病毒2型滅活疫苗。

一種豬圓環病毒2型滅活疫苗的生產方法，包括以下步驟：

⑴提供豬圓環病毒2型疫苗半成品病毒液，所述半成品病毒液為豬圓環病毒2型細胞培養液，病毒含量≥10^7.0TCID₅₀/ml；

⑵所述半成品病毒液經微濾中空纖維膜澄清過濾，收集濾過液，殘余液加入1/3~1倍體積量的pH 7.2的 PBS液，再次澄清過濾，收集洗液，混合所述濾過液和所述洗液，得到澄清過濾后的病毒液；

⑶將所述澄清過濾后的病毒液經100KD~1000KD超濾中空纖維膜濃縮純化，收集濃縮液，補加pH 7.2的PBS液進行洗滌，再次濃縮，最終獲得濃縮液為原病毒液體積的1/10~1/5；得到純化濃縮病毒液；

⑷按照所述純化濃縮病毒液的體積的0.05%~0.2%加入滅活劑，攪拌滅活24~36小時，滅活過程中控制滅活體系pH穩定在7.0~7.4之間；

⑸測定滅活抗原液中Cap蛋白含量，添加pH7.2 PBS液進行稀釋，使Cap蛋白含量定量于25~80μg/ml；

⑹抗原液與雙相佐劑混合乳化，制備豬圓環病毒2型滅活疫苗；

⑺疫苗效力評價：豬圓環病毒2型滅活疫苗與破乳劑按照體積比1:5~1:10震蕩混合，靜置至油相、水相分離，高速離心，棄去上層液體，室溫干燥后加入去離子水溶解析出蛋白，制備成疫苗蛋白液，測定疫苗蛋白液中Cap蛋白含量以快速評價疫苗質量。

上述技術方案中，步驟⑵中所述微濾中空纖維膜的孔徑為0.45μm或0.65μm。

上述技術方案中，步驟⑶中所述超濾中空纖維膜的孔徑為100KD或300KD。

上述技術方案中，步驟⑷中所述滅活劑為β-丙內酯、甲醛或戊二醛。