[發明專利]GST-SOD1-X-R9融合蛋白及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201710572456.9
• 申請日: 2017-07-14
• 公開（公告）號: CN107400167B
• 公開（公告）日: 2021-04-27
• 發明（設計）人: 潘劍茹;李玲玲
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;A61K38/44;A61P39/06;A61P39/00;A61K47/40
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明涉及融合蛋白領域，具體地提供一種GST?SOD1?X?R9融合蛋白及其制備方法與應用，采用基因重組技術，根據Genbank中人銅鋅超氧化物歧化酶的基因序列，融合連接肽X以及穿膜肽R9，得到SOD1?X?R9，將合成的SOD1?X?R9基因插入含有GST序列的pGEX4T?1質粒，得到pGEX4T?1?SOD1?X?R9表達質粒，然后在大腸桿菌BL21（DE3）中表達得到高表達量的可溶蛋白GST?SOD1?X?R9。本發明中融合蛋白GST?SOD1?X?R9不僅具有GST和SOD活力，在正常細胞環境中GST?SOD1?X?R9可通過R9穿膜進入細胞，清除胞內多余的自由基，保護細胞免受氧化損傷。

技術領域

本發明涉及融合蛋白領域，更具體地涉及GST-SOD1-X-R9融合蛋白及其制備方法與應用。

背景技術

惡性腫瘤是當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一，癌癥、心腦血管疾病和意外事故，是當今世界所有國家的三大死亡原因。放射治療是殺滅腫瘤的行之有效的手段，承擔著2/3腫瘤病人的治療。但因放療產生的自由基引起的輻射損傷副作用大，嚴重削弱了機體局部和整體的抵抗力，患者往往會因為這些副作用的發生而被迫中斷放療；輻射損傷副作用還可產生一些后期效應，影響患者的生存質量甚至危及生命。

電離輻射的作用有兩種，分別為直接作用和間接作用。直接作用是指射線直接將能量傳遞給生物分子，引起電離和激發，導致分子結構的改變和生物活性的喪失。間接作用則指射線首先作用于水，先通過細胞中水的輻解激活氧化酶和氮氧化物合成酶，引起水分子的活化和自由基的生成，然后通過自由基再作用于生物分子，造成它們的損傷。電離輻射也可能干擾線粒體功能，從而使脂質、蛋白質、核DNA（nDNA）和線粒體DNA（mtDNA）產生顯著變化。

由于射線的直接作用需要干燥的環境，生物體的含水量大，因此機體放射損傷主要由放射的間接作用導致。放射的間接作用通過水的電離在細胞內外產生自由基，然后自由基進一步損傷細胞和組織，從而造成機體損傷。輻射防護劑及各種輻射治療藥物通過作用于放療副作用的一個或幾個癥狀而發揮作用，如用于抗炎、抗感染的藥物等。既然放射損傷的主要原因為放射產生活性氧自由基的原發反應與繼發反應的綜合結果，清除自由基的抗氧化物質自然是最有效的放射防護劑。

天然抗氧化劑，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽還原酶等，通過與不同的自由基如超氧陰離子等作用，可防范自由基引發的損傷。低分子量抗氧化劑如抗壞血酸、生育酚、茶多酚、硫醇（如谷胱甘肽）等也可提供抗氧化防御。在這種情況下，氧化劑通過氫原子供體的作用阻斷或終止自由基連鎖反應鏈，從而阻止和抑制氧自由基引起損傷。

截至目前，在現有的抗氧化型放射防護劑中，已經應用于臨床的放射防護劑有阿米福汀和超氧化物歧化酶（SOD）。阿米福汀（AMFT）又名WR-2721，是人工合成的巰基類合成物，99年被批準用于頭頸癌放療引起的口干，但其價格昂貴，國產注射液每支（0.4 mg）售價高達800~1200元人民幣，且具有較大的毒性，會使大部分患者出現頭暈、惡心、嘔吐等不良反應，這些弊端致使其臨床使用逐漸減少。

SOD是一種天然抗氧化酶，是最值得一提的放射防護劑。因為電離輻射會生成超氧自由基，這種自由基活性高，對細胞極其有害，SOD是目前為止所發現的唯一可以清除這種自由基的酶。

SOD是一種十分重要的胞內酶，它能催化體內不同來源的超氧陰離子（O^2-）生成氧氣（O₂）和過氧化氫（H₂O₂），過氧化氫可在過氧化物酶或過氧化氫酶的作用下進一步生成水（H₂O）和氧氣，具有保護機體免受超氧陰離子自由基毒性的作用，但受其分子大小及其它特性的嚴格限制，無法透過細胞膜。早在70 年代中期，人們就發現了Cu, Zn-SOD 的防輻射作用，然而水分子受到電離輻射或巨噬細胞呼吸爆發等產生的自由基，不僅存在于細胞外，細胞內的含量也不少，只清除細胞外的自由基，自然無法根治放射損傷。