[發明專利]一株降鈣素原單克隆抗體雜交瘤細胞株CS12?1及其應用

在審

• 申請號: 201710570260.6
• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN107267465A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 胥傳來;郭玲玲;匡華;徐麗廣;馬偉;劉麗強;宋珊珊;吳曉玲;鄭乾坤
• 申請（專利權）人: 江南大學;得利斯集團有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/26;G01N33/74;G01N33/577;A61K39/395;A61P31/04;C12R1/91
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙)32104
• 代理人: 時旭丹,張仕婷

技術領域

本發明涉及一株降鈣素原單克隆抗體雜交瘤細胞株CS12-1及其應用，涉及降鈣素原（PCT）單克隆抗體的制備方法，以及臨床血清中PCT的雙抗體夾心酶聯免疫檢測方法的建立，屬于醫學免疫檢測技術領域。

背景技術

降鈣素原（PCT）編碼基因定位于人類第11號染色體，該基因由6個外顯子和5個內含子組成，總長7600 bp，其中編碼區長度為2800 bp. 基因轉錄后在甲狀腺濾泡旁細胞粗面內質網內翻譯成降鈣素原前體，進而在內源多肽酶的作用下修飾加工，生成116個氨基酸的終產物 PCT。 PCT可由細胞內特殊蛋白酶分解生成降鈣素，這種肽類激素對人體有重要的調節作用。正常情況下，PCT在血清中的含量非常低，僅為 10~50 pg/mL，然而在系統炎癥反應綜合癥、敗血癥、急慢性肺炎、急性胰腺炎等細菌性感染的患者血清中 PCT水平顯著升高，其濃度可達正常水平的幾千倍甚至上萬倍，而在局部感染、病毒感染、慢性非特異性炎癥等患者的血清中 PCT 濃度不增加或輕微增加，這就決定了 PCT 相較于其他血清標志物而言具有高度的特異性可作為細菌感染的特異性指標，用于細菌類疾病的鑒別診斷，為醫生是否使用抗生素提供有價值的參考。由于 PCT的濃度和疾病的嚴重程度呈正相關，并隨著病情的發展變化而變化，因此 PCT 又可作為判斷病情與愈后以及療效觀察的可靠指標，醫生可以通過監測 PCT 的變化從而觀察抗生素的治療效果，使患者及時得到針對性治療，縮短治療周期、減少治療費用，因此早期 PCT 的定量檢測臨床意義重大。

與其他 PCT 檢測方法相比，ELISA 檢測方法具有較高的敏感性和特異性、成本低、檢測時間短、無污染，可在大多數基層醫院使用。

發明內容

本發明的目的是提供降鈣素原單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，建立檢測降鈣素原的雙抗體夾心ELISA法。

本發明的技術方案：一株降鈣素原特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株CS12-1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號CGMCC No.13082，保藏日期2016年10月31日，分類命名單克隆細胞株。

降鈣素原特異性單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCC No. 13082的降鈣素原特異性單克隆抗體雜交瘤細胞株CS12-1分泌產生，命名為6F4。

所述降鈣素原特異性單克隆抗體的應用，以細胞株CS12-1分泌的抗體6F4為包被抗體，抗體6F4標記HRP后即6F4-HRP為酶標抗體，建立檢測天然PCT的雙抗體夾心ELISA法，在制備治療臨床早期細菌感染的藥物中的應用。

提供的PCT雜交瘤細胞株的制備方法基本步驟為：

（1）免疫原的制備：采用碳化二亞胺法，將PCT與牛血清蛋白（BSA）偶聯得到的PCT-BSA作為包被抗原。PCT-BSA的具體合成步驟如下：稱取5mg BSA，溶于2mL 0.1M pH7.4磷酸鹽緩沖溶液中，在不斷攪拌下，分別加入1mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亞胺），5mg PCT；室溫下，攪拌反應4h即可。

（2）動物免疫與效價測定：采用小劑量短周期方案免疫健康BALB/c 雌性小鼠，首次免疫用100μg PCT-BSA與等量弗氏完全佐劑混勻后進行皮下注射，間隔3周后，再用100μg PCT -BSA與等量弗氏不完全佐劑加強免疫，此后每隔3周用半量PCT-BSA加強免疫一次；沖刺免疫劑量減半，與等體積的生理鹽水混合后采用腹腔免疫，用PCT作為包被抗原，通過直接ELISA法檢測血清效價；

其具體ELISA 程序如下：

1)包被：將包被抗原用0.05M pH9.6 碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，100μL/孔，37℃孵育2h；

2)洗滌：將板內溶液傾去，每孔注入200μL PBST溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗滌3次；以下洗滌方法相同；

3)封閉：拍干后，加入200μL /孔封閉液，37℃孵育2h，洗滌后烘干備用；

4)加樣：將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，100μL/孔，37℃孵育30min；充分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，100μL/孔，37℃孵育30min，洗滌后拍干；

5)顯色：將酶標板取出，充分洗滌后，每孔加入100μL的顯色液（TMB與底物液體積比例1:5），37℃避光反應15min；

6)終止和測定：取出酶標板，每孔加入50μL終止液（2mol/L的硫酸）終止反應，然后用酶標儀測定各孔的吸光值OD_450nm。