[發(fā)明專利]一株分泌潮霉素B特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株ZXL-1及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710569918.1
• 申請(qǐng)日: 2017-07-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107177559B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胥傳來(lái);郭玲玲;匡華;徐麗廣;馬偉;劉麗強(qiáng);宋珊珊;吳曉玲;鄭乾坤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué);得利斯集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/20
• 分類號(hào): C12N5/20;C07K16/44;G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時(shí)旭丹;張仕婷

一株分泌潮霉素B特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株ZXL?1及其應(yīng)用，屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明一株分泌潮霉素B（HB）特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株ZXL?1，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏編號(hào)CGMCC No.13097。將得到的特異性分泌HB抗體的雜交瘤細(xì)胞株ZXL?1經(jīng)過(guò)腹水制備以及純化，即可得到抗HB單克隆抗體。該抗體可用于動(dòng)物源食品中HB殘留的免疫檢測(cè)，滿足目前市場(chǎng)上對(duì)HB快速免疫檢測(cè)產(chǎn)品的需求。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一株分泌潮霉素B特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株ZXL-1及其應(yīng)用，涉及潮霉素B單克隆抗體的制備方法，以及動(dòng)物源食品中潮霉素B的間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法的建立，屬于免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

潮霉素B，即Hygromycin B（HB）是一種由吸水鏈霉菌產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素，它可以通過(guò)抑制蛋白質(zhì)合成殺死細(xì)菌、真菌和高級(jí)真核細(xì)胞。具有一定的驅(qū)蟲(chóng)活性，在豬禽飼料中長(zhǎng)期添加，具有良好的驅(qū)線蟲(chóng)效果。

動(dòng)物源性食品中獸藥殘留問(wèn)題是近年來(lái)國(guó)際社會(huì)研究的公共衛(wèi)生熱點(diǎn)一，受到人們的普遍關(guān)注。由于臨床已證明HB具有耳毒性和腎毒性，因此歐盟規(guī)定禁止使用HB作為家畜的生長(zhǎng)促進(jìn)劑。鑒于這類抗生素在臨床應(yīng)用方面的副作用及易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，美國(guó)食品與藥品管理局（Food and Drug Administration）對(duì)動(dòng)物源性食品中氨基糖苷類獸藥殘留也極為關(guān)注。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235公告中規(guī)定HB可做畜禽類動(dòng)物治療用藥，但不得在相關(guān)動(dòng)物性食品中檢出。

目前，HB的最常用的檢測(cè)方法為高效液相色譜法等儀器檢測(cè)方法，該種檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)，操作需要掌握相關(guān)的專業(yè)技術(shù)，樣品前處理繁瑣等。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高靈敏、對(duì)技術(shù)人員要求低等特點(diǎn)，因此適用于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)快速篩查。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能夠分泌潮霉素B特異性單克隆抗體的細(xì)胞株制備方法，建立檢測(cè)潮霉素B的免疫學(xué)檢測(cè)方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一株分泌潮霉素B特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株ZXL-1，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，保藏編號(hào)CGMCCNo.13097，保藏日期2016年10月31日，分類命名單克隆細(xì)胞株。

潮霉素B特異性單克隆抗體，其是由所述保藏編號(hào)CGMCC No.13097的雜交瘤細(xì)胞株ZXL-1分泌產(chǎn)生。

所述潮霉素B特異性單克隆抗體的應(yīng)用，用于動(dòng)物源食品中潮霉素B的快速免疫檢測(cè)。

提供的潮霉素B雜交瘤細(xì)胞株的制備方法基本步驟為：

1、免疫原和包被原的制備：采用戊二醛法，將HB與牛血清蛋白（BSA）偶聯(lián)得到的免疫原HB-BSA；采用碳化二亞胺法，與雞蛋清白蛋白（OVA）偶聯(lián)得到的HB-OVA作為包被抗原。

HB-BSA的具體合成步驟如下：

a、稱取 10mg HB，溶于1mL 0.1M pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，再逐滴加入稀釋10倍后的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的戊二醛溶液100μL，室溫?cái)嚢?0min后，得到活化液；

b、稱取50mg BSA，溶于5mL 0.1M pH 9.0碳酸鹽緩沖溶液中，在不斷攪拌下，逐滴加入活化液，室溫下，反應(yīng)3～4h后，將反應(yīng)液用0.01M pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析，即可得到HB-BSA。

HB-OVA的具體合成步驟如下：

a、稱取20mg OVA，溶于3mL 0.1M pH6.0的一水合2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）溶液中；不斷攪拌下，先加入24mg N-羥基琥珀酰亞胺，15min后，再加入31mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亞胺）；在室溫下，攪拌2h，得到活化液；