[發明專利]一種增強凝血酶核酸適配體親和力的方法

有效

• 申請號: 201710569497.2
• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN107236743B
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 趙強;白云龍;李亞飄;汪海林
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/573
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

本發明公開了一種增強凝血酶核酸適配體親和力的方法。本發明提供了一種提高α凝血酶的核酸適配體Apt15親和力的方法，包括如下步驟：在凝血酶核酸適配體Apt15的3’末端延長大于等于18個T，得到α凝血酶的DNA核酸適配體，實現提高α凝血酶的核酸適配體Apt15親和力。Apt15可以與人α凝血酶的纖維蛋白原位點特異性結合，在特異檢測人α凝血酶有優勢，這種末端增加了T核苷酸的具有高親和力的適配體更有利于相應的核酸適配體在分析傳感、疾病治療診斷等領域的應用,在相關應用領域顯示出應用潛力。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種增強凝血酶核酸適配體親和力的方法。

背景技術

核酸適配體(Aptamer)是從隨機序列的寡聚核酸文庫中篩選得到的能夠與目標分子高親和力和高選擇性結合的單鏈核酸分子。與免疫抗體相比，核酸適配體顯示出諸多優點，如篩選制備無需動物，可以通過化學方法合成、容易引入修飾基團用于標記和固定化等。核酸適配體在分析傳感、疾病診斷治療、藥物開發等方面都顯示出潛力。凝血酶是血液中的一種重要蛋白酶負責血液的凝固等，同時也是一些疾病的標志物。1992年研究者報道了一種可與人α凝血酶(humanα-thrombin)特異結合的含15個核苷酸的DNA適配體(5’-GGTTGG TGT GGT TGG-3’,這里簡稱為Apt15)(L.C.Bock,L.C.Griffin,J.A Latham,E.H.Vermaas,J.J.Toole,Selection of single-stranded DNA molecules that bindand inhibit human thrombin,Nature 1992，355，564-566)，它的解離常數K_d約為100nM,可與凝血酶表面的纖維蛋白原結合位點作用。Apt15較低的親和力限制了Apt15在分析傳感等領域的應用。具有高親和力的核酸適配體在應用中顯示出優勢。發展一種可增強已有核酸適配體序列的親和力的方法，將有助于改善適配體的親和性能，有利于其應用。

發明內容

本發明的1個目的是提供一種提高α凝血酶的核酸適配體Apt15親和力的方法。

本發明提供的方法，包括如下步驟：在α凝血酶核酸適配體Apt15的3’末端延長大于等于18個T，得到α凝血酶的DNA核酸適配體，實現提高α凝血酶的核酸適配體Apt15親和力。

所述凝血酶核酸適配體Apt15的核苷酸序列為序列11，即為5’-GGT TGG TGT GGTTGG-3’。

上述方法中，所述在凝血酶核酸適配體Apt15的3’末端延長大于等于18個T為在凝血酶核酸適配體Apt15的3’末端延長大于等于18個T且小于等于35個T；

或所述在凝血酶核酸適配體Apt15的3’末端延長大于等于18個T為在凝血酶核酸適配體Apt15的3’末端延長18、19、20、21、22、23、24、25、30或35個T；

或，所述提高α凝血酶的核酸適配體Apt15親和力體現在所述α凝血酶的DNA核酸適配體的親和力大于所述核酸適配體Apt15的親和力。

在Apt15的3’端增加具有若干長度的聚胸腺嘧啶(T)核苷酸(polyT)，發現增加的polyT長度大于等于18個T后，核酸適配體的親和力明顯增強。利用這種在Apt15的3’端帶有polyT的高親和力適配體，在核酸適配體親和毛細管電泳分析法中能形成穩定的凝血酶-核酸適配體復合物，可以和未結合的適配體探針很好地分離開，進而實現對人α凝血酶的靈敏檢測。

本發明另一個目的是提供一種α凝血酶的DNA核酸適配體。

本發明提供的α凝血酶的DNA核酸適配體，為在凝血酶核酸適配體Apt15的3’末端延長大于等于18個T，得到α凝血酶的DNA核酸適配體。