[發(fā)明專利]植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性16SrDNA擴(kuò)增子制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710568923.0
• 申請(qǐng)日: 2017-07-13
• 公開（公告）號(hào): CN107312847A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 樊濟(jì)才;陳龍;張璐璐;高楠;胡秋萍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12N15/10
• 代理公司: 上海恒銳佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)31286
• 代理人: 黃海霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物多樣性高通量測(cè)序技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性的研究。

背景技術(shù)

植物內(nèi)生細(xì)菌(Endophytic bacteria)是能夠定殖于健康植物細(xì)胞間隙或者細(xì)胞內(nèi)，并與宿主植物建立起和諧聯(lián)合關(guān)系的一類微生物。它們可以為植物提供礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，也可以間接保護(hù)植物不受病原菌的侵害。但是在進(jìn)行植物內(nèi)生細(xì)菌的研究過程中，內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定一般比較困難。集合16S rDNA特異片段PCR擴(kuò)增與第二代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行植物內(nèi)生細(xì)菌的鑒定是近年來比較流行的一種方法，但是提取的總DNA中含有大量的宿主DNA，包括大量的線粒體DNA和葉綠體DNA等，給細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增子的制備造成了極大的干擾。使用傳統(tǒng)的引物如338F/806R、515F/907R等無法將細(xì)菌16S rDNA與宿主線粒體或者葉綠體DNA在高通量測(cè)序前進(jìn)行有效的分離，往往導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果中存在大量的植物宿主序列。發(fā)明人在使用引物338F/806R、515F/907R進(jìn)行植物內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA測(cè)序時(shí)發(fā)現(xiàn)，在測(cè)序數(shù)據(jù)中宿主的占比高達(dá)59.4％～92.8％。高的宿主數(shù)據(jù)占比將會(huì)嚴(yán)重浪費(fèi)測(cè)序數(shù)據(jù)量，影響對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性的分析。在內(nèi)生細(xì)菌相關(guān)的研究中為了獲得一定數(shù)據(jù)量的微生物數(shù)據(jù)，通常需要增加測(cè)序的通量，這也就意味著研究成本將大大增加。

文獻(xiàn)[1]中披露了使用引物799F/1492R擴(kuò)增植物內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA V5～V8區(qū)，可以有效減少宿主葉綠體DNA的擴(kuò)增，同時(shí)該引物擴(kuò)增宿主線粒體DNA與細(xì)菌16S rDNA的產(chǎn)物大小存在明顯的差異。文獻(xiàn)[2]披露了使用引物799F/1392R也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主葉綠體DNA擴(kuò)增的有效減少以及線粒體DNA與細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增子的顯著區(qū)分。基于文獻(xiàn)[3]中的方法，本發(fā)明人在SILVA SSU 128RefNR數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用TestPrimer工具測(cè)試引物799F/1492R和799F/1392R對(duì)細(xì)菌的覆蓋度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在序列完全匹配(0mismatch)時(shí)，引物799F/1492R和799F/1392R對(duì)細(xì)菌的覆蓋度分別為29.2％和69.8％。所述799F的序列為SEQ ID NO：1，所述1492R的序列為SEQ ID NO：3，所述1392R的序列為SEQ ID NO：2。但是無論是引物799F/1492R還是引物799F/1392R，其擴(kuò)增的細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增子均大于600bp，在以往的研究中主要基于454測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。然而，由于Roche(羅氏)公司不再生產(chǎn)用于454測(cè)序平臺(tái)的試劑，導(dǎo)致該平臺(tái)已于2016年退出市場(chǎng)。目前在二代測(cè)序市場(chǎng)中，Illumina公司的MiSeq測(cè)序平臺(tái)的測(cè)序讀長(zhǎng)最長(zhǎng)，可達(dá)300bp。但，即使使用MiSeq測(cè)序平臺(tái)的2×300測(cè)序模式進(jìn)行測(cè)序，在16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序項(xiàng)目的研究中也無法組裝出如此長(zhǎng)(≥600bp)的DNA片段。

許多研究顯示使用引物799F/1193R也可以有效減少宿主葉綠體DNA的擴(kuò)增，同時(shí)實(shí)現(xiàn)線粒體DNA與細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增子的分離，其中擴(kuò)增線粒體DNA的片段大小約為600bp，細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增子的大小約為400bp， 其目的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度可適用于目前的二代測(cè)序平臺(tái)(參考文獻(xiàn)[4]和文獻(xiàn)[5]和文獻(xiàn)[6])。但是本發(fā)明人在使用該引物進(jìn)行植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性16S rDNA測(cè)序研究時(shí)發(fā)現(xiàn)宿主葉綠體數(shù)據(jù)占比仍然較高，參考表1。

參考文獻(xiàn):

[1].Chelius M K,Triplett E W.The Diversity of Archaea and Bacteria in Association with the Roots of Zea mays L[J].Microbial ecology,2001,41(3):252-263.

[2].Bai Y,Müller D B,Srinivas G,et al.Functional overlap of the Arabidopsis leaf and root microbiota[J].Nature,2015,528(7582):364-9.

[3].Quast C,Pruesse E,Yilmaz P,et al.The SILVA ribosomal RNA gene database project:improved data processing and web-based tools[J].Nucleic acids research,2013,41:590-596.