[發(fā)明專利]抗除草劑蛋白及其基因在植物育種中的應用

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• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN107267480A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設計）人: 王崢;周寬基;李健;馬力耕;鄧興旺
• 申請（專利權）人: 未名興旺系統(tǒng)作物設計前沿實驗室（北京）有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于植物生物技術領域，具體而言，本發(fā)明涉及能賦予植物除草劑抗性的蛋白氨基酸序列及其在植物育種中的應用。

背景技術

農田中雜草是影響農作物產量的最重要因素之一，而人工除草所需要消耗的人力資源和成本很高，而且不便于農業(yè)集約化生產，嚴重制約了農作物種植向高產、優(yōu)質和低成本方向的發(fā)展進程。因此，除草劑就運應而生，其使用為解決農田草害、促進栽培方式的革新及增產中起了很大的作用。

目前發(fā)展抗除草劑作物的途徑主要有兩種：一種是通過轉基因手段將抗除草劑基因轉入作物中，最成功的案例是美國孟山都公司開發(fā)的一系列轉基因抗草甘膦除草劑作物品種農達 (Roundup)系列，包括抗農達大豆、玉米、棉花、油菜、向日葵和甜菜。但是利用轉基因基因技術培育的抗除草劑的作物品種需要經過較長時間的安全性評價，而且，從品種選育成功到生產應用的周期較長。第二種是利用遺傳學非轉基因的手段篩選作物抗除草劑突變體。該方法代表了目前國際抗除草劑作物培育的新方向。首先通過遺傳誘變的方法構建突變體庫，從中篩選到抗除草劑突變體，這樣得到的突變體可以直接作為抗除草劑新品種加以利用，或通過回交轉育的方法雜交到其他栽培品種。其優(yōu)點是非轉基因作物，不需要經過安全評估直接應用，產業(yè)化所需的批準時間短。因此我們選擇了后者作為獲得抗除草劑作物的方法。

乙酰羥基合成酶(AHAS，EC2.2.1.6)或者叫乙酰乳酸合成酶(ALS)是支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)生物合成途徑的第一個酶，也是幾種重要除草劑的靶位點，主要包括：咪唑啉酮類除草劑、磺酰脲類除草劑、三唑并嘧啶類除草劑、嘧啶基氧基苯甲酸酯類除草劑和磺?；被然蜻惓輨?。這五類除草劑與其靶位點乙酰羥基合成酶結合后，能夠抑制蛋白活性，從而阻止易感植物的生長發(fā)育。在模式植物擬南芥中的研究表明， AHAS蛋白某些氨基酸突變后能夠使擬南芥獲得除草劑抗性，突變后的蛋白不再與除草劑結合，同時又保持原有的生物學活性。

正是基于以上原理，本發(fā)明人通過長期而艱苦的研究實踐，在玉米作物中構建了突變體庫，并從中篩選到一系列抗除草劑突變體，并鑒定出賦予其除草劑抗性的蛋白。本發(fā)明人還開發(fā)了這些蛋白及其編碼基因在轉基因或者非轉基因植物育種中的應用，可用于培育具有除草劑抗性的植物，尤其是農作物，如抗除草劑玉米、水稻、小麥、高粱等。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題在于提供新的使植物具有除草劑抗性的蛋白質氨基酸序列和核苷酸序列，彌補原有專利或技術的不足。另外，本發(fā)明還提供了編碼這些蛋白質的核酸以及基因工程中間體(如，表達盒、載體和細胞等)，獲得具有除草劑抗性的植物的方法和應用，并且提供了判斷植物是否采用本發(fā)明方法或提供的抗性蛋白獲得抗性的鑒定方法。

具體而言，本發(fā)明提供了一種對乙酰羥酸合酶(Acetohydroxy acid synthase，AHAS) 類抑制劑具有耐受性的突變體植株，所述突變體植株的基因組DNA發(fā)生了突變，與野生型對照相比，突變位點發(fā)生在AHAS基因編碼框的第1862bp，該位點發(fā)生了由G到A的點突變，從而導致該基因編碼的蛋白質第621位氨基酸由絲氨酸(Ser，S)變?yōu)樘於０?Asn，N)，具有該突變位點的植株可以耐受AHAS抑制劑類除草劑。

在本發(fā)明中，AHAS抑制劑類除草劑包括磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸嘧啶類等除草劑(Peter Babczinski,Thomas Zelinski.Mode of action herbicidal ALS-inhibitors on acetolactate synthase from green plant cell cultures，yeast，and Escherichia coli.Pesticide science,1991,31:305-323；鄭培忠,沈健英.乙酰乳酸合成酶抑制劑的種類及其耐藥性研究進展.雜草科學,2009,2:4-8)。因此，在本發(fā)明中除草劑抗性指的是對包括磺酰脲類、咪唑啉酮類、嘧啶并三唑類、水楊酸嘧啶類在內的除草劑具有耐受性。優(yōu)選在本發(fā)明中，除草劑是咪唑啉酮類除草劑，如在本發(fā)明的具體實施方式中，除草劑是咪唑乙煙酸。即優(yōu)選在本發(fā)明中，除草劑抗性是咪唑啉酮類除草劑抗性，更優(yōu)選是咪唑乙煙酸抗性。