[發(fā)明專利]一種熒光定量檢測INHB的免疫層析試劑條及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710568452.3
• 申請日: 2017-07-13
• 公開（公告）號: CN107167595A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 胡鹍輝;錢純亙;夏福臻;張賽;宋永波
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/533
• 代理公司: 深圳市千納專利代理有限公司44218
• 代理人: 袁燕清

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于免疫診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光定量檢測抑制素B（INHB）的免疫層析試紙條及其制備方法。

背景技術(shù)

抑制素B(inhibin B, INH-B)是睪丸來源的糖蛋白激素，成年男性體內(nèi)血清抑制素B水平與FSH呈顯著負相關(guān)，對FSH起負反饋作用。男性出生后不久，血清抑制素B水平逐漸上升，抑制素B與FSH之間一直維持負相關(guān)關(guān)系。20~30歲時，抑制素B水平到達高峰，此后抑制素B水平隨年齡增加逐漸降低。

生精功能低下與生精阻滯男性血清抑制素B水平顯著低于正常生精功能男性，唯支持細胞綜合征（SCO）男性血清抑制素B水平極低，SCO的發(fā)生與血清抑制素B的水平顯著相關(guān)，血清抑制素B的水平還與睪丸體積、精子總數(shù)顯著相關(guān)。抑制素B水平反映了整個睪丸組織的功能，是輸精管道的直接產(chǎn)物，成年男性血清中維持可檢測的抑制素B水平需要生精細胞的存在，因此抑制素B被認為是男性精子發(fā)生的血清標志物。血清抑制素B測定可用于評價男性不育病人的生精功能，兒童隱睪、性早熟的診斷，對非阻塞性無精子癥病人睪丸精子抽吸的預測，監(jiān)測放、化療對男性生精功能的損傷等。

目前臨床上INHB的檢測方法有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、電化學發(fā)光法和化學發(fā)光法，這些方法都有各自的優(yōu)點和不足。ELISA法檢測步驟多、耗時長，操作過程的影響因素較多，易造成假陽性和假陰性結(jié)果。因此目前逐步被化學發(fā)光法替代，但這類方法為全封閉系統(tǒng)，價格昂貴，需要專門培訓儀器使用人員，維修及檢測成本高，并且不適合單人份和小批量檢測用，目前不利于INHB檢測在國內(nèi)的廣泛開展。

鑒于目前尚無快速、準確的定量檢測INHB的方法，本發(fā)明的目的是提供一種可用于快速定量檢測INHB的免疫層析試紙條，用于評估和監(jiān)測男性生精功能，所述試劑具有操作簡單、方便快捷、經(jīng)濟、準確定量等優(yōu)點，更適用于在各醫(yī)療機構(gòu)廣泛開展。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種操作簡單、方便快捷、經(jīng)濟、測定準確的INHB檢測試紙條。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種熒光定量檢測INHB的免疫層析試紙條，由樣品墊、標記墊、包被膜、吸水紙順次搭接在PVC底板上構(gòu)成，所述標記墊上噴涂有熒光微球標記的INHB單克隆抗體和熒光微球標記的親和素；所述包被膜包含檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線包被有與所述熒光微球標記的INHB單克隆抗體處于不同表位的另一種INHB單克隆抗體。所述質(zhì)控線包被有特異性識別親和素的兔抗親和素抗體。

優(yōu)選地，所述熒光微球標記的INHB單克隆抗體的濃度為0.1~1.0 mg/mL，稀釋比例為5%~20%。所述熒光微球標記的親和素的濃度為0.1~1.0 mg/mL，稀釋比例為0.5%~5%。所述含熒光微球標記的INHB單克隆抗體和熒光微球標記的親和素的標記墊處理液的噴量為3~6 μL/cm。

優(yōu)選地，所述熒光微球的粒徑為100~500 nm。所述熒光微球的激發(fā)波長為310~550 nm，發(fā)射波長為340~ 620 nm。

優(yōu)選地，所述包被膜檢測線上包被的INHB單克隆抗體的濃度為0.5~2 mg/mL，噴量0.1~0.2μL/mm。所述質(zhì)控線上包被的兔抗親和素抗體的濃度為0.5~2 mg/mL，噴量0.1~0.2μL/mm。

本發(fā)明還提供一種熒光定量檢測INHB的免疫層析試紙條的方法，包括以下步驟：

（1）熒光微球標記蛋白的制備

取一定量的熒光微球，10000~15000 rpm離心5~15分鐘，沉淀物用10~100 mM pH6.0~7.0磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)濃度為0.1%~1%，并超聲分散；加入終濃度為0.1~5 mg/mL的碳二亞胺（EDC），混勻，再加入終濃度為0.1~5 mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），混勻；室溫孵育20~40分鐘后10000~15000 rpm離心5~15分鐘，沉淀物用10~100 mM pH6.0~7.0磷酸鹽緩沖液溶解。將復溶后的熒光微球超聲分散，按照0.1~1.0 mg/mL熒光微球的比例分別加入INHB單克隆抗體和親和素，混勻后室溫旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)1.5~3小時，10000~15000 rpm離心5~15分鐘，沉淀物用含10~40 mM乙醇胺和0.05%-1%酪蛋白的Tris-HCl（10~40mM，pH 7.0-8.0）復溶，超聲分散后旋轉(zhuǎn)混合反應(yīng)0.5~1小時。10000~15000 rpm離心5~15分鐘，沉淀用微球保存液復溶，2~8℃保存。

（2）樣品墊的預處理