[發明專利]一種的微生物菌株及其選育方法和應用

有效

• 申請號: 201710566643.6
• 申請日: 2017-07-12
• 公開（公告）號: CN107164286B
• 公開（公告）日: 2021-01-08
• 發明（設計）人: 陽飛;蘇正定;賀一君;系祖斌;盧方欣;張華山;成細瑤
• 申請（專利權）人: 湖北共同生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12N13/00;C12P33/00;C07J7/00;C12R1/32
• 代理公司: 北京睿智保誠專利代理事務所(普通合伙) 11732
• 代理人: 周新楣

本發明提供了一種用于微生物菌株及其選育方法和應用，包括：以分枝桿菌菌株CCTCCNO:M2012522為出發菌株，將菌株經固體活化培養基在斜面或平板培養活化，然后將活化的菌株通過液體培養基制備成菌體濃度為10⁷～10⁸個/mL的第一菌懸液；將第一菌懸液進行紫外?LiCl復合誘變，分離后培養，挑取單菌落進行活化和發酵；以紫外?LiCl復合誘變篩選出的菌株制備第二菌懸液，菌體濃度為10⁷～10⁸個/mL，進行亞硝基胍誘變，分離后培養，挑取單菌落進行活化和發酵，篩選后得到雙降醇生產菌株。然后對雙降醇提取工藝進行優化，獲得高純度的精制產品。與現有技術相比，本發明得到了遺傳性狀穩定的雙降醇生產菌株，優化提取技術，為進一步工業化生產奠定了良好的基礎。

技術領域

本發明屬于生物發酵技術領域，具體涉及一種用于制備雙降醇的微生物菌株及其選育方法和應用。

背景技術

甾體藥物是品種多和應用廣泛的一大類藥物，臨床上需求量僅次于抗生素，主要用于治療風濕病、心血管、膠原性病癥、淋巴白血病、腫瘤、細菌性腦炎、皮膚病、內分泌失調、老年性疾病等疾病。我國在甾體藥物研究開發與世界先進國家相比還有一定的差距，主要表現為甾體藥物合成步驟多，反應復雜，基團的遠程效應十分明顯，收率低，特別是分離純化困難。圖1為植物甾醇轉化雙降醇的途徑及關鍵酶系。

雙降醇(21-hydroxy-20-methylpregn-4-en-3-one)分子式為C₂₂H₃₄O₂，分子量為330.5，是甾體激素類藥物的一種重要中間體，可以用作甾體藥物黃體酮和氫化可的松的合成，具有重要的商業價值。微生物降解植物甾醇的的工作開始于20世紀60年代，目前已經發現許多微生物可以降解植物甾醇，包括Arthrobacter，Brevibacterium，Pseudomonas，Nocardia，BaciI/us，Streptomyces，Microbacterium，Achromobacter，Protaminobacter，Comamonas，Mycobacterium；fIJRhodococcus等菌種，微生物通過體內酶系高效降解植物甾醇側鏈以及氧化母核環。研究表明，9-羥化酶KshA與KshB共同催化形成9-羥基雄烯二酮，從而進一步催化最終降解為二氧化碳和水。研究表明，C₂₂脫氫酶是植物甾醇生成4-雄烯二酮與雙降醇的關鍵酶系，脫氫活力較高時主要向4-雄烯二酮轉化，而相對較弱時主要向雙降醇途徑轉化。此外也有研究表明，3-甾酮-Δ¹-脫氫酶(3-ketosteroiddelta1-dehydrogenase)可以促使4-雄烯二酮與雙降醇分別轉化為1，4-雄烯二酮與1，4-雙降醇。湖北共同生物科技有限公司通過誘變方法(專利號CN103382445A)成功獲得9-羥化酶缺陷菌株，保藏在武漢大學中國典型微生物保藏中心，編號為CCTCCNO:M2012522。本發明在前期的誘變株基礎之上進一步采用紫外線-LiCl以及亞硝基胍復合誘變方法得到C_1，2脫氫酶以及C₂₂脫氫酶雙重缺陷菌株，從而富集轉化生產雙降醇。

發明內容

本發明的目在于提供一種用于制備雙降醇的微生物菌株及其選育方法和應用，得到遺傳性狀穩定的雙降醇生產菌株，同時優化提取工藝，獲得高純度的雙降醇精制產品。

為了實現上述的目的，本發明采用以下技術方案：

一種微生物菌株，為分枝桿菌屬分支桿菌種，拉丁文為Mycobacterium sp.HBCBA-1，保藏單位為中國典型菌種保藏中心，保藏地址中國武漢大學，保藏日期為2017年6月19日，保藏號為CCTCCNO：M2017349，主要特征為細胞為桿狀，革蘭氏染色為陽性G+，過氧化氫酶陽性，V.P.反應、甲基紅試驗以及吲哚試驗均為陰性。

一種上述菌株的選育方法，包括以下步驟：