[發明專利]一種抗凍百合及利用抗凍蛋白基因轉化百合的方法

有效

• 申請號: 201710565356.3
• 申請日: 2017-07-12
• 公開（公告）號: CN107267550B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 顏笑灑;張業勝;李艷霞;王文;董揚
• 申請（專利權）人: 云南納博生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/56
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛;蔣晗

1.一種抗凍蛋白基因，其特征在于，所述抗凍蛋白基因為AF1基因，基因序列如SEQ IDNO.3所示。

2.如權利要求1所述的抗凍蛋白基因，其特征在于，所述AF1基因是對極地凍魚基因AFPIII進行植物密碼子優化得到的，極地凍魚基因AFPIII的序列如SEQ ID NO.4所示，優化后的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一種利用權利要求1所述的抗凍蛋白基因轉化百合的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟（1）通過酶切連接的方法將AF1基因插入Pcambia1390骨架載體，并采用PCISV啟動子啟動，構建AF1基因植物表達載體P1390- PCISV -AF1；

步驟（2）將表達載體P1390- PCISV -AF1電擊轉化農桿菌菌株，菌落經PCR檢測后，載體P1390- PCISV -AF1轉化入農桿菌菌株中；

步驟（3）通過農桿菌介導的遺傳轉化方法將AF1基因轉化到受體百合愈傷組織中，經PCR鑒定，確定AF1基因已整合到百合基因組后；將愈傷組織在無抗性培養基上進行生長恢復培養，然后移至分化培養基上培養;侵染條件為培養菌液至OD值為0.2-1.0，侵染時間為5-15min，共培養培養基中AS濃度為10-100 umol/L,得到百合陽性植株。

4.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（1）中所述Pcambia1390上包含EcoR I/Spe I酶切位點，使用引物對P1390-PCISV-F/R，以PCISV啟動子為模板，進行PCR反應，進行Pcambia1390載體與PCISV啟動子的酶切連接反應，用變溫循環進行酶切連接反應；然后將連接產物熱激轉化E. coli DH5α感受態細胞，用LB平板篩選抗性質粒，提取質粒，獲得中間表達載體P1390-PCISV，使用PCISV啟動子特異的引物對PCISV-F/R進行測序驗證；

所述PCISV啟動子與載體Pcambia1390連接前需要進行改造，使PCISV啟動子帶有EcoRI、Kpn I、Pml I、Sac I、Xba I和Spe I酶切位點。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，改造過的PCISV啟動子下游攜帶酶切位點及順序為Kpn I、PmL I、Sac I、Xba I、Spe I，選擇Kpn I和Spe I作為候選位點，對合成的AF1基因進行酶切位點改造使其帶有Kpn I和Spe I酶切位點，使用引物對P1390-AF1-F/R，以AF1基因為模板，進行PCR實驗，然后選用內切酶Kpn I和Spe I，完成P1390-PCISV與AF1基因的連接，進而將連接產物熱激轉化E. coli DH5α感受態細胞，用LB平板篩選抗性質粒，小量提取質粒，獲得AF1基因植物表達載體，以AF1特異的引物對AF1-F/R進行測序驗證。

6.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（2）采用電擊法將表達載體P1390-PCISV-AF1轉化農桿菌菌株，電轉完成的菌液在28~30℃，振蕩培養1.5~2.5h，涂平板于YM固體培養基，28~30℃恒溫培養箱中培養1d；挑取單菌落于YM液體培養基中，28~30℃振蕩培養1.5~2.5h至OD值為0.3-0.6，使用引物對HYG-f/r對潮霉素基因進行菌落PCR擴增。

7.如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（3）使用百合無菌苗的種球鱗片，誘導鱗片切片長出愈傷組織；在滅菌組培瓶中加入含抗生素的YM液體培養基，取步驟（2）得到的農桿菌菌種的菌液，加入到YM液體培養基中，培養至菌液OD在0.2-0.6之間，活化菌種；低溫離心棄上清，加入懸浮培養基混勻；將菌液倒入三角瓶中，將百合愈傷切塊加入三角瓶中，封口，真空泵中抽真空到0.3~0.5kPa，持續10~20min侵染；共培養基上培養3~5天后轉移到篩選培養基上，培養10~20天后將經篩選未死亡的愈傷組織塊再次接種到新的篩選培養基上，二次篩選培養20~40天，至收獲抗性苗，將抗性苗接入生根培養基中培養。

8.如權利要求3所述的方法，其特征在于，侵染條件為培養菌液至OD值為0.2，侵染時間為15min，共培養培養基中AS濃度為100 umol/L，共培養時間為3天。