[發(fā)明專利]一種Δ5-3-酮類異構酶基因、包含該基因的載體及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710564918.2
• 申請日: 2017-07-12
• 公開（公告）號: CN107345227B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發(fā)明（設計）人: 陽飛;彭飛;蘇正定;賀一君;系祖斌;盧方欣;張華山;成細瑤
• 申請（專利權）人: 湖北共同生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/61;C12N15/70;C12N1/21;C12P33/00;C12R1/19
• 代理公司: 石家莊圖歌知識產權代理事務所(普通合伙) 13136
• 代理人: 張金榮

本發(fā)明提供了一種異構酶轉化植物甾醇的方法。一種Δ5?3?酮類異構酶及編碼該酶的基因、Δ5?3?酮類異構酶的表達載體和利用該載體轉化的重組微生物，如基因工程菌株，以及提供該Δ5?3?酮類異構酶的基因工程菌株的應用。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程和酶工程領域，具體涉及Δ5-3-酮類異構酶基因、其表達載體、其表達的Δ5-3-酮類異構酶及其應用。

背景技術

甾體激素類藥物是世界上僅次于抗生素的第二大類藥物，具有對機體進行非常重要的調節(jié)作用，被譽為生命的鑰匙，成為臨床上不可缺少的藥物，已經(jīng)被廣泛應用于消炎、避孕、治療心血管疾病、抗腫瘤、人體器官移植、內分泌失調和老年性疾病等。雄甾-4-烯-3,17-二酮，簡稱雄烯二酮(Androstenedione)(4-AD)，分子式為C₁₉H₂₆O₂，是生產甾體激素類藥物不可替代的關鍵中間體。

研究表明，4-AD在體內就像是甾體激素類化合物的營養(yǎng)補充劑，可以作為雄激素和雌激素的前體，通過代謝生成雌雄激素來維持機體的正常運轉，如人體內對運動性能很重要的睪酮，其含量的二分之一就是通過腺外4-AD轉化而來。

另外，人們發(fā)現(xiàn)4-AD也具有蛋白同化激素的特性。而在體外，通過大量的研究發(fā)現(xiàn)，以4-AD作為起始原料幾乎可以生產所有腎上腺皮質激素、性激素及蛋白同化激素等甾體激素類藥物，如用于治療心血管疾病的坎利酮、普利酮和螺內酯等和用作避孕藥的性激素類藥物炔諾酮等，都可以通過4-AD生產，目前工業(yè)上用4-AD生產的藥物有100余種，4-AD已成為生產這些甾體激素類藥物的基本原料，并且它的應用領域也在不斷的擴大，不僅合成常用的甾體激素類藥物，還應用于新藥的研發(fā)和生產。

目前，工業(yè)上制備甾體藥物4-AD主要途徑是分支桿菌以植物甾醇為原料轉化生產4-AD。由于轉化菌株難以篩選、目標產物收率較低并且轉化過程有中雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)的產生，兩者化學結構類似，分離起來困難。因此經(jīng)濟成本較高。

發(fā)明內容

由于Δ5-3-酮類異構酶(KSI)可催化Δ5-3-酮基甾體化合物的C5，C6位雙鍵轉移至C4，C5位，如反應圖1所示。因此，另一種方法是構建表達Δ5-3-酮類異構酶(KSI)基因的工程菌。

本發(fā)明的目的是提供一種Δ5-3-酮類異構酶基因，所述Δ5-3-酮類異構酶基因的表達產物，表達載體及KSI在雄甾-5-烯-3,17-二酮(5-AD)為底物高效專一轉化生產4-AD中的應用。

一種Δ5-3-酮類異構酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的Δ5-3-酮類異構酶基因序列是來自分枝桿菌HGMS2GL。通過對分枝桿菌HGMS2GL的全基因組測序，從基因組中以PCR的方法提取Δ5-3-酮類異構酶基因SEQ IDNO.1。由于遺傳密碼子的簡并性，本發(fā)明的Δ5-3-酮類異構酶基因還可以是編碼由SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的其他核苷酸序列。

一種上述基因的編碼蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的Δ5-3-酮類異構酶不僅限于具有序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質，還可以是將SEQ ID NO.2中的氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有相同酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的蛋白質，比如在N末端或C末端添加一個或數(shù)個氨基酸，如與載體編碼的氨基酸融合、不影響序列的修飾形式上的差異等情況。

一種表達載體，包含上述的Δ5-3-酮類異構酶基因。