[發明專利]一種高效創建國蘭有性多倍體的方法

在審

• 申請號: 201710561524.1
• 申請日: 2017-07-11
• 公開（公告）號: CN107347627A
• 公開（公告）日: 2017-11-17
• 發明（設計）人: 曾瑞珍;雷蕾;郭和蓉;杜國輝;謝利;朱嬌;張志勝
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: A01H1/02
• 分類號: A01H1/02;A01H4/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 任重

1.一種高效創建國蘭有性多倍體的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1. 親本選擇和雜交組合配置：選擇高效發生2n配子的雜交蘭或國蘭做親本，配置雜交組合，獲得果實；

S2. 種子培養和中間繁殖體鑒定：對蘭花種子進行無菌培養獲得中間繁殖體，將單粒種子形成的中間繁殖體進行繼代增殖培養，觀察中間繁殖體形態、生長速度，選擇粗壯、尖端圓鈍、增殖速度較慢的中間繁殖體；

S3. 植株再生和試管苗形態觀察：對選到的中間繁殖體進行分化培養和生根壯苗培養，對形成的再生植株進行形態學觀察，選擇國蘭株型、植株粗壯、葉色深、葉厚、根粗壯、根尖端圓鈍的植株；

S4. 細胞學鑒定和有性多倍體的獲得：對當選的植株進行測定，染色體數為60條或以上的為多倍體。

2.根據權利要求1所述高效創建國蘭有性多倍體的方法，其特征在于，步驟S1親本選擇中母本為小香，父本為兔耳蘭。

3.根據權利要求1所述高效創建國蘭有性多倍體的方法，其特征在于，所述步驟S2包括以下步驟：

S21. 果實消毒、接種和初代培養：將雜交后150-270天的果實洗凈，然后用75%乙醇消毒8~10分鐘，無菌水沖洗3~5次，取其內部種子接種到固體培養基上培養；培養條件為溫度26℃，暗培養；

S22. 中間繁殖體的增殖：將種子萌發后形成的中間繁殖體分開，將單個中間繁殖體或將其切成長度2~8 mm小段，分別接種于繼代培養基上培養；培養條件為溫度26℃，每日光照8~12小時，光照強度500~1000lux；

S23. 中間繁殖體形態觀察：對中間繁殖體的繁殖速度、形態特征進行觀察，選擇粗壯、尖端圓鈍、增殖速度較慢的中間繁殖體。

4.根據權利要求3所述的高效創建國蘭有性多倍體的方法，其特征在于，S21所述固體培養基配方為：1/2MS培養基+0.2～0.5mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+10～20%（v/v）椰子汁+30g/L糖+0.3～2g/L活性炭+7.5g/L卡拉膠。

5.根據權利要求3所述的高效創建國蘭有性多倍體的方法，其特征在于，所述的步驟S22中增殖培養基配方為1/2MS培養基+0.5～2 mg/L 6-BA+0.1～0.2mg/L NAA+0.2～0.5g/L 活性碳+30g/L糖+7.5g/L卡拉膠。

6.根據權利要求1所述的高效創建國蘭有性多倍體的方法，其特征在于，S3所述植株再生和試管苗形態觀察包括如下步驟：

S31. 芽分化培養：將繼代培養的中間繁殖體分開，接種于芽分化培養基上培養，培養條件為溫度26℃，每日光照10小時，光照強度1000~2000lux；

S32. 生根壯苗培養：將高2~4cm從中間繁殖體上切下，接種到生根壯苗培養基上培養，培養條件為溫度26℃，每日光照10小時，光照強度1000~2000lux；

S33. 試管苗觀察：對試管苗及其形成過程進行觀察，生長慢、形成過程時間長，粗壯、葉片厚，葉色深、根短粗壯、根尖部圓鈍的試管苗為擬似多倍體，以形態正常的植株做對照。

7.根據權利要求6所述的高效創建國蘭有性多倍體的方法，其特征在于，S31所述的芽分化培養基配方為：1/2MS培養基+1.5～2.0mg/L 6-BA+0.1～1mg/L NAA+30g/L糖+0～0.3g/L活性炭+7.5g/L卡拉膠。

8.根據權利要求6所述的高效創建國蘭有性多倍體的方法，其特征在于，步驟S32中生根壯苗培養基配方為：1/2MS培養基+0.1～0.2mg/L 6-BA+0.5～2mg/L NAA+20～40g/L糖+0.2～0.5g/L活性炭+7.5g/L卡拉膠。

9.根據權利要求1所述的高效創建國蘭有性多倍體的方法，其特征在于，S4包括以下步驟：

S41. 流式細胞儀鑒定：以試管苗葉片為材料，根尖細胞染色體為40的二倍體為對照，采用Partec-cyview85流式細胞儀確定當選擬似多倍體植株的倍性；

S42. 根尖細胞染色體鑒定：以幼嫩根尖為材料，采用壓片法鑒定當選試管苗根尖細胞染色體數，染色體數為40時為二倍體，染色體為60或以上時為多倍體；

S43. 有性多倍體的獲得：將確定為多倍體的試管苗進行移栽和栽培，即可獲得有性多倍體。