[發(fā)明專利]水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白E基因表達(dá)載體及其重組酵母菌株與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710559992.5
• 申請(qǐng)日: 2017-07-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109234302A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 肖楊;王雨;高媛;劉昊智;毛普加;袁軍;李津;吳克
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢博沃生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N15/66;C12N15/38;C12N1/19;C12R1/84
• 代理公司: 上海精晟知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31253
• 代理人: 熊嫻;張超宇

本發(fā)明公開(kāi)了一種水痘?帶狀皰疹病毒糖蛋白E基因真核表達(dá)載體及其重組酵母菌株與應(yīng)用，所述載體為如SEQ ID NO：1所示的水痘?帶狀皰疹病毒糖蛋白E的基因全序列與pGAPZαA的連接體。本發(fā)明公開(kāi)的畢赤酵母的表達(dá)系統(tǒng)中能夠成功表達(dá)水痘?帶狀皰疹病毒的糖蛋白E，為后續(xù)該蛋白免疫原性檢測(cè)及在畢赤酵母中的高效表達(dá)以及水痘帶狀皰疹疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體說(shuō)，是涉及一種可用于表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白E基因的表達(dá)載體及其重組酵母菌與應(yīng)用。

背景技術(shù)

水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)是皰疹病毒屬(Herpesviridae)α皰疹病毒亞科成員，是一種直徑150～200nm的DNA病毒，形態(tài)學(xué)上是由核酸內(nèi)心、蛋白衣殼和包膜構(gòu)成的同心圓狀結(jié)構(gòu)，表面由162各殼微粒組成的對(duì)稱正二十面體，有嗜皮膚和神經(jīng)的特征，在幼兒及老年人群中多發(fā)病的一種雙鏈DNA病毒，是一種發(fā)病快、傳染性高的疾病。它可引起水痘和帶狀皰疹兩種常見(jiàn)病，還可引起腦炎、肺炎等嚴(yán)重并發(fā)癥；而患者痊愈后少量殘存的病毒潛伏于體內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞中，待機(jī)體免疫力低下時(shí)又會(huì)大量繁殖，從而導(dǎo)致疼痛性的疾病帶狀皰疹(herpes zoster)。在免疫受損的個(gè)體中，VZV感染的發(fā)病率和病死率都很高。VZV引起的疾病及其相關(guān)后遺癥已逐漸成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，并日益受到人們的重視。

VZV殼外有一層或多層的含脂蛋白的包膜，整個(gè)VZV基因組是一種包含有72個(gè)開(kāi)放閱讀框，約編碼67種蛋白，能編碼8種糖蛋白gE、gB、gH、gI、gC、gL、gK以及gM的序列，其中糖蛋白E(glycoprotein E，gE)是一種晚期結(jié)構(gòu)蛋白，分子量較大，由ORF68基因編碼，屬于I型膜蛋白，是生成感染性病毒顆粒的必需糖蛋白也是病毒在感染細(xì)胞中含量最高、抗原性最強(qiáng)的糖蛋白，廣泛存在于在VZV顆粒的表面和宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜和胞質(zhì)中，病毒包膜上的含量最高，是被免疫系統(tǒng)識(shí)別的第一個(gè)糖蛋白，能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫。在病毒的不同成熟階段以不同的含糖多肽形式存在，是體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答的重要靶點(diǎn)。糖蛋白E包含623個(gè)氨基酸殘基，包括兩個(gè)抗原決定簇編碼區(qū)e1和c1，在變異的VZV柱間這些抗原決定簇是穩(wěn)定的，因此VZV糖蛋白E有穩(wěn)定的表位，具有較高的保守性，是比較合適的疫苗抗原候選單位。其中g(shù)E而在處于恢復(fù)期的水痘和帶狀皰疹的患者血清中，VZV抗體最主要的針對(duì)gE，其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫以及細(xì)胞免疫，從而保護(hù)個(gè)體抵抗病毒的感染。一般情況下，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白往往會(huì)出現(xiàn)由于缺少二硫鍵的形成、磷酸化以及糖基化修飾、加工作用，使得最后表達(dá)的蛋白以無(wú)活性或者活性較低的包涵體形式存在，這對(duì)蛋白的表達(dá)以及后續(xù)的純化都是很大的障礙。KR100434023B1公開(kāi)了以動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)一種大數(shù)量的一種糖蛋白的水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)。具體是通過(guò)一種雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體，plced4gpiis，含有一種基因編碼一種蛋白gpiis，其是通過(guò)除去的疏水性位點(diǎn)產(chǎn)生在所述羧基-末端的一種VZV的糖蛋白，GP II b，由第六百九十九至第八百六十八氨基酸，和二氫葉酸還原酶(dhfr)基因，在其兩個(gè)基因是通過(guò)一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)節(jié)。該動(dòng)物細(xì)胞系的CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)-gpiis#3(KCTC～2A13abp)是通過(guò)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系的CHO產(chǎn)生與所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體plced4gpiis。以及用于表達(dá)該表面抗原糖蛋白的方法，具體為：培養(yǎng)該動(dòng)物細(xì)胞線CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)-gpiis#3(KCTC～2A13abp)的培養(yǎng)基中含有methotreaxate(MTX)；增加該濃度的MTX在該介質(zhì)通過(guò)步驟以誘導(dǎo)該本發(fā)明的表達(dá)DHFR基因和gpiis基因；和分離所表達(dá)的蛋白gpiis從所培養(yǎng)的培養(yǎng)基。該方法主要是通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)，該表達(dá)系統(tǒng)價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本高且周期長(zhǎng)。CN102517302A公開(kāi)了一種重組表達(dá)水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E的方法及其應(yīng)用。該方法是將去除跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)并添加His標(biāo)簽的水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)截短型糖蛋白E(gpE)的基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，經(jīng)表達(dá)得到重組水痘-帶狀皰疹病毒截短型糖蛋白E。該表達(dá)方法有助于提高目的蛋白的表達(dá)量，簡(jiǎn)化了下游的純化工作，可較容易地實(shí)現(xiàn)蛋白的規(guī)模化生產(chǎn)，且批間質(zhì)量穩(wěn)定。以本發(fā)明重組蛋白作為捕獲抗原可用于血漿樣本中抗水痘-帶狀皰疹病毒特異性免疫球蛋白的間接ELISA檢測(cè)，可提高臨床診斷VZV感染的準(zhǔn)確性，并用于其它需要VZV特異性免疫球蛋白進(jìn)行高通量檢測(cè)的領(lǐng)域。此方法為原核表達(dá)且主要用于VZV感染檢測(cè)，并不適用制備VZV免疫組合物。李福民等人公開(kāi)了一種用PCR方法擴(kuò)增VZV糖蛋白E基因，并將其克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1并用雙酶切和測(cè)序方法鑒定。結(jié)果擴(kuò)增的目的基因包括了全長(zhǎng)的糖蛋白E基因，長(zhǎng)度約1.9kb；并且成功構(gòu)建了糖蛋白E基因重組表達(dá)載體(實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，Practical Journal of ClinicalMedicine，2006年02期，ISSN：1672-6170)。伊興旭等人公開(kāi)了一種構(gòu)建含有VZV g E胞外域基因的真核表達(dá)質(zhì)粒p CDNA3.1-g E，測(cè)序后脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)VZV gE的細(xì)胞株。采用RT-PCR法檢測(cè)VZV gE的mRNA，Western blot和間接免疫熒光法檢測(cè)gE的免疫反應(yīng)性，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后包被ELISA板，對(duì)127份0～10歲正常兒童血清中VZV-Ig G抗體水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果成功篩選出能夠穩(wěn)定表達(dá)VZV gE胞外域基因的COS-7細(xì)胞株，RT-PCR檢測(cè)到gE的mRNA，經(jīng)Western blot和間接免疫熒光鑒定，gE具有明顯的免疫反應(yīng)性，COS-7細(xì)胞株和其培養(yǎng)上清液中均有g(shù)E融合蛋白，表達(dá)量約為0.632mg/mL，純度約為90％。ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了127份0～10歲兒童血清中VZV-Ig G抗體，總陽(yáng)性率為81.89％，特異度和靈敏度分別為93.75％和88.24％(安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，ActaUniversitatis Medicinalis Anhui，2015年03期，ISSN：1000-1492)。李春明等人公開(kāi)了一種用Oka株VZV(VZV-Oka)感染人二倍體細(xì)胞(2BS株)，提取基因組DNA，以其為模板，PCR擴(kuò)增gE537目的片段，克隆至載體pCI-neo，構(gòu)建重組真核表達(dá)質(zhì)粒p CI-neo-g E537-His。大量擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，瞬時(shí)表達(dá)，經(jīng)鎳柱純化，獲得目的蛋白gE537-His，Western blot和ELISA法進(jìn)行鑒定。結(jié)果經(jīng)雙酶切及測(cè)序鑒定，重組真核表達(dá)質(zhì)粒pCIneo-gE537-His構(gòu)建成功。200mmol/L咪唑洗脫液為洗脫目的蛋白的最佳咪唑濃度。純化產(chǎn)物可與鼠抗gE糖蛋白單抗于相對(duì)分子質(zhì)量約90 000處發(fā)生特異性結(jié)合，且可與mAb-10、mAb-12抗gE單抗發(fā)生反應(yīng)(中國(guó)生物制品學(xué)雜志，Chinese Journal of Biologicals，2016年11期，ISSN：1004-5503)。伊興旭公開(kāi)了一種VZVgE基因胞外域的克隆、表達(dá)方法，具體為：從臨床采集帶狀皰疹患者的皮膚囊泡液接種至單層人胚胎成纖維細(xì)胞(human embryofibroblast，HF)，進(jìn)行病毒分離；對(duì)分離的病毒株進(jìn)行特征性細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathiceffect，CPE)，間接免疫熒光和DNA測(cè)序鑒定。將確認(rèn)的VZV臨床分離株體外培養(yǎng)，PCR擴(kuò)增VZV g E基因胞外域片段，分別構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒gE-p ET-32a(+)和真核表達(dá)質(zhì)粒g E-pCDNA3.1/myc-His(-)，測(cè)序后將原核質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，以異丙基硫代β-D-半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)，獲得VZV g E原核表達(dá)的融合蛋白。通過(guò)SDS-PAGE電泳、Western blot鑒定融合蛋白的特異性，利用Ni2+-NTA柱對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化及柱上復(fù)性。將真核質(zhì)粒用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞，經(jīng)G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)VZV g E蛋白的細(xì)胞株，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni2+-NTA柱純化；通過(guò)RT-PCR檢測(cè)VZV g E基因的m RNA，Western blot和間接免疫熒光檢測(cè)g E融合蛋白的免疫反應(yīng)性。分別用純化后的原核表達(dá)g E蛋白和真核表達(dá)g E蛋白免疫新西蘭家兔，獲得兔抗VZV g E多克隆抗體(安徽醫(yī)科大學(xué)，碩博論文)。上述表達(dá)方法均是通過(guò)動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)，該表達(dá)系統(tǒng)價(jià)格昂貴，生產(chǎn)成本高且周期長(zhǎng)。