[發明專利]一種快速評估睪丸生精功能的免疫熒光染色法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201710559950.1
• 申請日: 2017-07-11
• 公開（公告）號: CN107315092B
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 趙亮宇;姚晨成;李錚;李朋;孫紅芳;田汝輝;萬眾;陳慧興;楊超;朱子玨
• 申請（專利權）人: 上海市第一人民醫院
• 主分類號: G01N33/58
• 分類號: G01N33/58;G01N1/30;G01N21/64
• 代理公司: 上海卓陽知識產權代理事務所(普通合伙) 31262
• 代理人: 周春洪

1.一種用于快速評估睪丸組織生精功能的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括熒光標記的染料試劑D1、試劑D2，所述試劑D1由熒光標記的兔抗人源GFRA1抗體及熒光標記的鼠抗人源c-KIT抗體組成；所述試劑D2由熒光標記的兔抗人源SCP3抗體及熒光標記的鼠抗人源PNA抗體組成；所述試劑盒還包括陰性對照抗體染料試劑D3，所述試劑D3由488驢抗兔IgG熒光二抗及555驢抗鼠IgG熒光二抗組成；所述試劑盒還包括：試劑A:紅細胞裂解液；試劑B：4％多聚甲醛固定液；試劑C：含5％胎牛血清和0.5％Triton X-100的PBS液；試劑E：熒光封片劑；試劑F：PBS液；所述試劑盒還包含操作說明書，所述操作說明書記載以下內容：試劑準備階段：用試劑C分別按一定比例稀釋試劑D1、D2、D3，制成工作液；生精小管玻片制備階段：(1)取人生精小管，用試劑F漂洗；(2)取出廢液，加入試劑B，室溫孵育；(3)當血塊、血液較多時，棄廢液，加入試劑A，室溫搖床放置；(4)棄廢液，加入試劑F洗滌，重復兩次；(5)當染色背景較高時，棄廢液，加入試劑C，室溫孵育；(6)取出生精小管分成三份，分別放入三個試管中分別放入D1、D2、D3工作液，室溫孵育15-30min；(7)棄廢液，加入試劑F洗滌，重復兩次；(8)取出生精小管放置在一載玻片上，小心將其盡量鋪展開，使用試劑E封片處理，在熒光顯微鏡下觀察，根據觀察結果，判斷受試者的生精功能情況；所述試劑盒還包含染色結果說明書，所述結果說明書記載以下內容：生精情況的病理分類主要分為三種類型，分別為生精正常、生精阻滯、無生精或生精低下；(1)所述生精正常判斷標準為：所有生精小管GFRA1陽性、c-KIT陽性、SCP3陽性和PNA陽性；(2)所述生精阻滯判斷標準為：①所有生精小管GFRA1陽性、c-KIT陽性、SCP3陽性和PNA陰性；②所有生精小管GFRA1陽性、c-KIT陽性、SCP3陰性和PNA陰性；③所有生精小管GFRA1陽性、c-KIT陰性、SCP3陰性和PNA陰性；(3)所述無生精或生精低下判斷標準為：①無生精：所有生精小管GFRA1陰性、c-KIT陰性、SCP3陰性、PNA陰性；②生精低下：所有生精小管GFRA1陽性、c-KIT陽性、SCP3陽性和PNA陽性但是數量偏低或者生精灶只存在于生精小管的部分區域；另外，試劑D3的染色結果作為陰性對照，根據陰性對照排除生精小管的自發熒光和非特異染色。

2.由熒光標記的兔抗人源GFRA1抗體和熒光標記的鼠抗人源c-KIT抗體組成的抗體組合物和由熒光標記的兔抗人源SCP3抗體及熒光標記的鼠抗人源PNA抗體組成的抗體組合物聯合在制備快速評估睪丸組織生精功能的試劑盒中的應用，所述試劑盒還包括陰性對照抗體染料試劑D3，所述試劑D3由488驢抗兔IgG熒光二抗及555驢抗鼠IgG熒光二抗組成；所述試劑盒還包括：試劑A:紅細胞裂解液；試劑B：4％多聚甲醛固定液；試劑C：含5％胎牛血清和0.5％Triton X-100的PBS液；試劑E：熒光封片劑；試劑F：PBS液；還包含操作說明書，所述操作說明書記載以下內容：試劑準備階段：用試劑C分別按一定比例稀釋試劑D1、D2、D3，制成工作液；生精小管玻片制備階段：(1)取人生精小管，用試劑F漂洗；(2)取出廢液，加入試劑B，室溫孵育；(3)當血塊、血液較多時，棄廢液，加入試劑A，室溫搖床放置；(4)棄廢液，加入試劑F洗滌，重復兩次；(5)當染色背景較高時，棄廢液，加入試劑C，室溫孵育；(6)取出生精小管分成三份，分別放入三個試管中分別放入D1、D2、D3工作液，室溫孵育15-30min；(7)棄廢液，加入試劑F洗滌，重復兩次；(8)取出生精小管放置在一載玻片上，小心將其盡量鋪展開，使用試劑E封片處理，在熒光顯微鏡下觀察，根據觀察結果，判斷受試者的生精功能情況；所述試劑盒還包含染色結果說明書，所述結果說明書記載以下內容：生精情況的病理分類主要分為三種類型，分別為生精正常、生精阻滯、無生精或生精低下；(1)所述生精正常判斷標準為：所有生精小管GFRA1陽性、c-KIT陽性、SCP3陽性和PNA陽性；(2)所述生精阻滯判斷標準為：①所有生精小管GFRA1陽性、c-KIT陽性、SCP3陽性和PNA陰性；②所有生精小管GFRA1陽性、c-KIT陽性、SCP3陰性和PNA陰性；③所有生精小管GFRA1陽性、c-KIT陰性、SCP3陰性和PNA陰性；(3)所述無生精或生精低下判斷標準為：①無生精：所有生精小管GFRA1陰性、c-KIT陰性、SCP3陰性、PNA陰性；②生精低下：所有生精小管GFRA1陽性、c-KIT陽性、SCP3陽性和PNA陽性但是數量偏低或者生精灶只存在于生精小管的部分區域；另外，試劑D3的染色結果作為陰性對照，根據陰性對照排除生精小管的自發熒光和非特異染色。