[發(fā)明專利]一種羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體雙重PCR專用引物及雙重PCR檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710559840.5
• 申請(qǐng)日: 2017-07-11
• 公開（公告）號(hào): CN107299154A
• 公開（公告）日: 2017-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 寧長(zhǎng)申;閆亞群;崔艷艷;趙姍姍;王曉星;張艷;史柯;菅復(fù)春;張龍現(xiàn);王榮軍;景紀(jì)春
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州中原專利事務(wù)所有限公司41109
• 代理人: 趙磊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體雙重PCR專用引物及雙重PCR檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

羊泰勒蟲病(Ovine And CaprineTheileriosis)是由泰勒科泰勒屬的原蟲寄生于綿羊和山羊巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)所引起的疾病的總稱，屬于一種由媒介蜱傳播的蜱傳性血液原蟲病(Neitz W O 1957，Barnett S F 1977，Morel P C et al,1981)。泰勒蟲于1914年第一次在埃及被發(fā)現(xiàn)(Littlewood 1915)，而中國(guó)最早于1958年由楊輔國(guó)等報(bào)道了四川的羊泰勒蟲病(Yang et al，1958)。該病能引起山羊和綿羊發(fā)熱、貧血癥和黃疸等臨床癥狀，使羊只發(fā)育遲緩，產(chǎn)肉量和產(chǎn)毛量顯著下降，并可引起羔羊和外來(lái)羊只大量死亡，從而限制了地方性養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展和生產(chǎn)，到目前為止，已有六種羊泰勒蟲被報(bào)道，分別為致病力較強(qiáng)的萊氏泰勒蟲(Theilerialestoquardi)、呂氏泰勒蟲(T.luwenshuni)和尤氏泰勒蟲(T.uilenbergi)，以及對(duì)羊致病力很弱或無(wú)致病性的綿羊泰勒蟲(T.ovis)、分離泰勒蟲(T.separata)和隱藏泰勒蟲(T.recondita)。其中T.luwenshuni、T.uilenbergi和T.ovis均在國(guó)內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。根據(jù)報(bào)道，我國(guó)東南地區(qū)、西北地區(qū)和中部地區(qū)的山羊和綿羊均有T.luwenshuni感染。

嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體(A.phagocytophilum，AP)于1932年在蘇格蘭地區(qū)首次被發(fā)現(xiàn)，引起了羊的不明發(fā)熱，由于發(fā)現(xiàn)該病與牧草中的蜱蟲有關(guān)，將其稱為蜱傳熱病(TBF)。由A.phagocytophilum引起的人粒細(xì)胞無(wú)形體病(human granulocytic anaplasmosis,HGA)是人獸共患病，最初該病原被稱為人粒細(xì)胞埃立克體，后來(lái)將其重新分類歸屬于立克次體目，無(wú)漿體科，無(wú)漿體屬，更名為人粒細(xì)胞無(wú)漿體(A.phagocytophilum)，A.phagocytophilum具有廣泛的宿主群，包括人類、野生動(dòng)物和家畜等，是對(duì)人和動(dòng)物都有較強(qiáng)致病性的人畜共患病原體，屬于自然疫源性疾病，可引起反芻動(dòng)物的急性和慢性傳染病，A.phagocytophilum能誘導(dǎo)機(jī)體立即產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，介導(dǎo)免疫活性細(xì)胞及炎性因子對(duì)宿主細(xì)胞的攻擊，最終導(dǎo)致免疫抑制及潛在疾病引起的各種繼發(fā)感染和器官衰竭，患病特征主要表現(xiàn)為膽囊腫大、貧血、黃疸、高熱、消瘦，嚴(yán)重者甚至可以導(dǎo)致死亡。

A.phagocytophilum作為一種人和多種動(dòng)物的人獸共患病病原，具有公共衛(wèi)生學(xué)意義，受到人們的高度重視，嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體病的發(fā)生呈季節(jié)分布，主要發(fā)生在媒介硬蜱活動(dòng)期間，在中國(guó)部分地區(qū)硬蜱、森林革蜱、長(zhǎng)角血蜱等都是嗜吞噬細(xì)胞無(wú)形體的傳播媒介，易感動(dòng)物和人經(jīng)感染幼蜱叮咬造成感染傳播。我國(guó)2006年在安徽省報(bào)告發(fā)現(xiàn)HGA病病例，此后在山東、湖北、河南、浙江等省陸續(xù)有發(fā)病報(bào)道，在安徽、湖北等省家畜中都檢測(cè)到A.phagocytophilum，在新疆伊犁地區(qū)也有家畜感染該病的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體雙重PCR專用引物及雙重PCR檢測(cè)方法。

本發(fā)明的目的是以下述方式實(shí)現(xiàn)的：

一種羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體雙重PCR專用引物，引物的核苷酸序列為：

羊呂氏泰勒蟲專用引物T.lu7：

T.lu7F：5’-TGCTGCATTGCATCTTCT-3’，如SEQ NO.1所示；

T.lu7R：5’-AGGGACGTAATCTGCACAAG-3’，如SEQ NO.2所示；

嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體專用引物SSAP2：

SSAP2F：5’-GCTGAATGTGGGGATAATTTAT-3’，如SEQ NO.3所示；

SSAP2R：5’-ATGGCTGCTTCCTTTCGGTTA-3’，如SEQ NO.4所示。

所述羊呂氏泰勒蟲專用引物T.lu7的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為962bp，嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體專用引物SSAP2的擴(kuò)增產(chǎn)物大小為641bp。

利用上述的羊呂氏泰勒蟲和嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體雙重PCR專用引物進(jìn)行雙重PCR檢測(cè)的方法，包括以下步驟：

(1)待測(cè)樣品DNA的提取；

(2)將引物對(duì)T.lu7和SSAP2分別配置成濃度為25μM/L的溶液；