[發(fā)明專利]一種重組干擾素的基因工程菌的高密度發(fā)酵方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710559776.0
• 申請(qǐng)日: 2017-07-11
• 公開（公告）號(hào): CN107190033A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李振義
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京寶易生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12P21/00
• 分類號(hào): C12P21/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于發(fā)酵過程技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及一種重組干擾素的基因工程菌的高密度發(fā)酵方法。

背景技術(shù)

干擾素(Interferon，IFN)，是由英國(guó)科學(xué)家Isaacs于1957年利用雞胚絨毛尿囊膜研究流感病毒干擾現(xiàn)象時(shí)首先發(fā)現(xiàn)的，是一種細(xì)胞因子，具有抑制細(xì)胞分裂、調(diào)節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤等多種作用。其本質(zhì)是蛋白質(zhì)，類型可分為α、β、γ、ω等幾種。IFN能誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)病毒感染產(chǎn)生抗性，它通過干擾病毒基因轉(zhuǎn)錄或病毒蛋白組分的翻譯，從而阻止或限制病毒感染，是目前最主要的抗病毒感染和抗腫瘤生物制品。

干擾素是一種很時(shí)髦的新藥。據(jù)報(bào)道，干擾素越來越神奇了，開始還只是治愈一些流感、肝炎、水痘之類的小毛病，有點(diǎn)小家子氣的味道。現(xiàn)在對(duì)付許多腫瘤、癌癥還有白血病都用上了干擾素，不再是小打小鬧。不但如此，由于它的越來越現(xiàn)代的生產(chǎn)方式，基因工程干擾素也已上市多年了。

但是，要使干擾素成為藥品，進(jìn)入實(shí)際應(yīng)用當(dāng)中，必須有足夠的量。那么，如何獲得大量的干擾素呢？人們首先想到，用病毒刺激老鼠，讓它們產(chǎn)生干擾素，再提取出來供人使用，但是這種方法失敗了。原因是干擾素的活動(dòng)場(chǎng)所很專一，老鼠體內(nèi)產(chǎn)生的干擾素對(duì)人不管用。所以最理想的辦法是用人自身產(chǎn)生的干擾素。

人們最初想到的是，通過血液制取干擾素。可惜，干擾素在血液中的含量實(shí)在是太少了，用大量的血液才能制得微量的干擾素，這種生產(chǎn)方式產(chǎn)量低得可憐，自然價(jià)格也就十分昂貴。治療一個(gè)病人的費(fèi)用高達(dá)幾萬(wàn)美元，一般百姓只能望“藥”興嘆，是名副其實(shí)的“貴族藥”，干擾素?zé)o法得到普及、推廣。

其實(shí)，我們生活的環(huán)境是被微生物包圍著的，時(shí)時(shí)刻刻都要接觸到許多微生物，其中病毒的侵染刺激也不少。科學(xué)家猜測(cè)，人的血液細(xì)胞里本身就存在干擾素。后來研究證明，這種猜測(cè)是有道理的，通過精密的血液分析，在人和許多動(dòng)物的細(xì)胞中都找到了干擾素。

既然蛋白質(zhì)是干擾素的本質(zhì)，那么把制造成這種蛋白質(zhì)的遺傳基因找出來，轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，讓它們代勞進(jìn)行大量生產(chǎn)，也許能行。經(jīng)過科學(xué)家的試驗(yàn)，干擾素的批量生產(chǎn)便成為可能。1980年，終于實(shí)現(xiàn)了干擾素的批量生產(chǎn)，這是美國(guó)科學(xué)家的杰作，他們利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建了生產(chǎn)干擾素的基因工程。

如今，運(yùn)用基因工程技術(shù)的國(guó)家有：美國(guó)、日本、法國(guó)、比利時(shí)、德國(guó)、英國(guó)以及中國(guó)等。通過DNA重組、大腸桿菌發(fā)酵等方法，大量獲取各種干擾素。經(jīng)過試驗(yàn)明，這樣制得的干擾素對(duì)乙型肝炎、狂犬病、呼吸道發(fā)炎、腦炎等多種傳染病的病毒都有一定療效。干擾素能減緩癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，是很有希望的防癌治癌藥物，具有非常誘人的前景。

根據(jù)近幾年來我國(guó)禽病發(fā)生、發(fā)展的規(guī)律來看，部分疾病已經(jīng)顯現(xiàn)出其強(qiáng)大的毀滅性，如禽流感、新城疫等疾病的不斷流行，給養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。而干擾素在臨床當(dāng)中用于控制疾病起到了其不可替代的作用。

總的來說，目前干擾素在基礎(chǔ)理論和實(shí)踐應(yīng)用上仍需要進(jìn)行大量的研究，但相信隨著干擾素進(jìn)入分子生態(tài)學(xué)研究階段，動(dòng)物干擾素的分子結(jié)構(gòu)、理化特性、生物學(xué)特性、產(chǎn)生和作用機(jī)理不斷得到闡明，各種動(dòng)物干擾素基因得到克隆和表達(dá)，基因工程產(chǎn)品的問世，將給目前嚴(yán)重危害畜牧業(yè)生產(chǎn)的疾病，特別是病毒性和腫瘤性疾病的防治帶來新的希望。此外，由于γ干擾素具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)功能，可以開發(fā)用于體質(zhì)弱、免疫功能低下的病畜。目前應(yīng)用干擾素誘生劑和人工干擾素產(chǎn)品治療病毒性疾病取得了一定進(jìn)展，今后一段時(shí)間內(nèi)要加快基因工程干擾素產(chǎn)品的商品化研制，制劑類型、途徑、劑量、毒副作用等。相對(duì)而言，由中草藥等誘生劑誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN，因純化工藝復(fù)雜，產(chǎn)量少、作用緩和等諸多因素影響而極大限制了在臨床和科研上的應(yīng)用。如在規(guī)模化生產(chǎn)中推廣使用干擾素，必須建立高效生產(chǎn)干擾素體系，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)重組干擾素是一條有效的途徑。目前，基于延長(zhǎng)干擾素在體內(nèi)的代謝半衰期的長(zhǎng)效干擾素研究已經(jīng)獲得了初步成功，干擾素的聚乙二醇化Pegylated Interferon和干擾素與載體脂質(zhì)體Liposome-IFN的結(jié)合被認(rèn)為是兩種很好的延長(zhǎng)干擾素在體內(nèi)的半衰期、增加其穩(wěn)定性、降低免疫源性的有效手段，這擴(kuò)大了干擾素的應(yīng)用范圍，同時(shí)減少了刺激和毒副反應(yīng)的發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明優(yōu)化了發(fā)酵、補(bǔ)料培養(yǎng)基及補(bǔ)料方法，保證了菌體快速生長(zhǎng)代謝所需要的營(yíng)養(yǎng)條件及外部環(huán)境，大大提高了下罐時(shí)的菌體含量及產(chǎn)物產(chǎn)量，菌體含量由現(xiàn)有的25g/L提高到了45g/L。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種重組干擾素基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，包括以下步驟：