[發明專利]用于鑒定烤煙秦煙96的引物組合及試劑盒、應用及鑒定方法

有效

• 申請號: 201710557210.4
• 申請日: 2017-07-10
• 公開（公告）號: CN107345252B
• 公開（公告）日: 2020-10-13
• 發明（設計）人: 張劍鋒;魏攀;武明珠;王中;盧鵬;金靜靜;許亞龍;李澤鋒;李鋒
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 鄭州睿信知識產權代理有限公司 41119
• 代理人: 牛愛周

1.用于鑒定烤煙秦煙96的引物組合，其特征在于：所述引物針對烤煙秦煙96的12個特異性SNP位點側翼序列設計，包含這12個SNP位點的基因序列如SEQ ID NO:1~12所示, 所述基因序列SEQ ID NO:1~12的N依次為A、T、C、G、T、C、A、T、T、T、T、A。

2.根據權利要求1所述的引物組合，其特征在于：所述12個特異性SNP位點的引物序列如SEQ ID NO:13~48所示。

3.包含如權利要求1或2所述引物組合的烤煙秦煙96鑒定試劑盒。

4.如權利要求1或2所述引物組合、權利要求3所述試劑盒在烤煙秦煙96品種鑒定方面的應用，其特征在于：包括：取煙草樣本基因組DNA進行SNP分型檢測，若檢測樣本中12個SNP位點的基因型與烤煙秦煙96的完全一致，則判定該煙草樣本為烤煙秦煙96；烤煙秦煙96中12個SNP位點的基因型依次為AA、TT、CC、GG、TT、CC、AA、TT、TT、TT、TT、AA。

5.采用如權利要求2所述引物組合鑒定烤煙秦煙96的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）SNP位點多重PCR擴增反應

以煙草樣本基因組DNA為模板，利用引物組合中的擴增引物進行多重PCR擴增反應，得PCR產物；

2）SAP酶反應

用SAP酶去除PCR產物中剩余的dNTP和引物，得反應產物；

3）單堿基延伸反應

在反應產物中加入延伸引物進行單堿基延伸反應，得延伸產物；

4）基因型檢測及結果判定

對延伸產物進行預處理，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術進行SNP基因型檢測，若檢測樣本中12個SNP位點的基因型與烤煙秦煙96的完全一致，則判定該煙草樣本為烤煙秦煙96；烤煙秦煙96中12個SNP位點的基因型依次為AA、TT、CC、GG、TT、CC、AA、TT、TT、TT、TT、AA。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟1）中多重PCR擴增反應為：反應體系：10×PCR 緩沖液0.5μL、25mM MgCl₂ 0.4μL、25mM dNTPs 0.1μL、5U/μL PCR Enzyme 0.2μL、1μM擴增引物的混合液1μL、10ng/μL煙草樣本基因組DNA 1μL，水補足至5μL；反應條件為：94℃ 30s；94℃ 5s，52℃ 5s、80℃ 5s、5個循環，40個循環；72℃ 3min。

7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟2）中SAP酶反應為：在PCR產物中加入1.7U/μL SAP 0.3μL和10×SAP 緩沖液0.17μL，水補足至7μL；反應條件為：37℃ 40min，85℃ 5min。

8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟3）中單堿基延伸反應為：在反應產物中加入10×iPLEX緩沖液0.2μL、10×iPLEX termination mix 0.2μL、33U/μL iPLEXEnzyme 0.041μL和1μM延伸引物的混合液0.94μL，水補足至9μL；反應條件為：94℃ 30s；94℃ 5s，52℃ 5s、80℃ 5s、5個循環，40個循環；72℃ 3min。

9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：步驟4）中預處理為：在延伸產物中加入水41μL，潔凈樹脂15mg，混勻后進行脫鹽去離子處理，離心取上清液備用；將上清液點樣到芯片上，用MALDI-TOF質譜儀掃描芯片，得到SNP基因型檢測結果。