[發明專利]用于鑒定烤煙畢納1號的引物組合及試劑盒、應用及檢測方法

有效

• 申請號: 201710557206.8
• 申請日: 2017-07-10
• 公開（公告）號: CN107354203B
• 公開（公告）日: 2019-12-27
• 發明（設計）人: 張劍鋒;金靜靜;吳壽明;何聲寶;金鑫;羅朝鵬;謝小東;王中;楊軍
• 申請（專利權）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 41119 鄭州睿信知識產權代理有限公司
• 代理人: 胡云飛

本發明涉及用于鑒定烤煙畢納1號的引物組合及試劑盒、應用及檢測方法，屬于煙草品種鑒定技術領域。本發明利用煙草420K高密度SNP芯片對近年來我國煙草主栽品種進行全基因組SNP分型，根據品種間多態性SNP位點篩選獲得了一套適用于鑒定烤煙畢納1號的特異性SNP標記共15個，并對比栽培煙草參考基因組獲得的15個SNP位點側翼序列，其序列如SEQ ID NO:1～15所示，基于該序列設計引物；利用設計的引物，采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術對這些位點進行分型檢測。根據檢測結果獲得SNP分型結果，鑒定樣品是否為畢納1號，本發明的檢測方法檢測時所需檢測樣品量少，檢測通量高，鑒定結果準確。

技術領域

本發明涉及用于鑒定烤煙畢納1號的引物組合及試劑盒、應用及檢測方法，屬于煙草品種鑒定技術領域。

背景技術

煙草是一種重要的經濟作物，是卷煙生產的主要原料。烤煙品種畢納1號是貴州省煙草公司畢節市公司采用系統選育方法從烤煙品種云煙85自然變異株中選育而成的烤煙新品種，于2012年10月通過全國煙草品種審定委員會貴州省煙草品種審定組審定。株型呈塔型，打頂后呈筒型，自然株高210cm左右，打頂株高150cm左右，自然葉數32左右，可采葉數24～26片，莖圍9～10cm，節距4.5cm，腰葉長78.2cm，寬29.4cm，頂葉長61.5cm、寬21.7cm；葉形長橢圓形，葉色綠色，葉耳大，葉尖漸尖，花冠粉紅色；田間生長整齊，生長勢較強，煙葉分層落黃好，易烘烤；移栽至中心花開放72天左右，大田生育期135天左右。畢納1號是近年來我國煙葉生產中重要的主栽烤煙品種，也是卷煙生產中重要的工業常用品種。

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)主要是指在基因組上由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態性。與傳統的分子標記相比，SNP標記具有密度高、分布范圍廣、分型簡單等優點。隨著全基因組序列鑒定技術以及自動化的SNP芯片分型技術的發展，利用大規模、高通量SNP芯片進行遺傳多樣性研究已經變得越來越普遍。國家煙草基因研究中心設計研制出首張煙草高密度SNP芯片(420K Tobacco SNP array)，涵蓋絕大多數標簽SNP位點并均勻分布整個煙草基因組，為從全基因組水平上對煙草品種進行遺傳多樣性研究提供了便利。采用煙草高密度SNP芯片標記技術對煙草主栽品種的遺傳多樣性進行分析，可以篩選獲得特定主栽品種的特異性SNP分子標記。基于基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術的MassARRAY分子量陣列平臺可以針對SNP位點設計最高多達40重PCR反應和基因型檢測，實驗設計非常靈活，分型結果準確性高。根據應用需要，對于數十到數百個SNP位點進行數百至數千份樣本檢測時，MassARRAY具有極高性價比。特別適合于對有限數量的SNP位點進行大規模分型檢測。

品種是優質煙葉原料生產的基礎，是影響煙葉品質最主要的因素之一。根據《中華人民共和國種子法》和《煙草專賣法》，為保證煙葉生產的穩定性和可持續發展，必須選用經全國煙草品種審定委員會審(認)定的品種，嚴禁種植劣雜品種。此外，煙草工業生產和產品開發對特定煙葉品種也提出了嚴格的要求。目前，我國面臨著煙草主栽品種的遺傳背景狹窄，形態學上相似程度高難以區分鑒別的問題。煙草品種的檢測方法主要是田間種植鑒定法。但是，該方法存在田間種植規模大、鑒別項目多(鑒別性狀涉及株高、葉數、節距、葉長、葉寬、莖葉角度等)、周期長(跨越煙草不同生育期)、鑒別難度大(性狀指標差異小)、同一性狀年度間存在差異(受環境影響)等不足。煙草品種保護，種子純度的監測，煙葉真假檢測等方面，都迫切需要從分子水平上進行煙草DNA身份鑒定。

專利CN105734141A公開了一種鑒定煙草品種純度的分子生物學方法，包括：分別提取對照與待測煙草品種的基因組總DNA，采用最新測序技術對其進行適當深度的全基因組測序，基于煙草基因組參考序列利用生物信息學手段對它們進行序列拼接、組裝與全基因組序列比較，統計二者堿基差異，計算出待測煙草品種相對于對照煙草品種的純度百分比。該方法不受環境條件和季節影響，鑒定結果準確可靠，可從最小遺傳單位單堿基變異水平上準確鑒別煙草品種的純度，用于煙草品種親本提純與真偽鑒定。但是該方法操作復雜，檢測成本非常高。