[發(fā)明專利]用于鑒定烤煙云煙97的引物組合及試劑盒、應(yīng)用及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710556639.1
• 申請(qǐng)日: 2017-07-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107354201B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-12-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張劍鋒;楊軍;蔡聯(lián)合;李澤鋒;盧鵬;許亞龍;金靜靜;羅朝鵬;謝小東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 41119 鄭州睿信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 胡云飛

1.用于鑒定烤煙云煙97的引物組合，其特征在于：所述引物針對(duì)烤煙云煙97的13個(gè)特異性SNP位點(diǎn)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)，包含13個(gè)SNP的位點(diǎn)基因序列如SEQ ID NO:1~13所示；所述序列SEQ ID NO:1~13的n依次為T(mén)、A、A、A、A、A、T、A、A、T、T、C、T。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物組合，其特征在于：所述13個(gè)特異性SNP位點(diǎn)的引物序列如SEQ ID NO:14~52所示。

3.包含如權(quán)利要求1或2所述引物組合的烤煙云煙97鑒定試劑盒。

4.如權(quán)利要求1或2所述引物組合、權(quán)利要求3所述試劑盒在烤煙云煙97品種鑒定方面的應(yīng)用。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：包括：取煙草樣本基因組DNA進(jìn)行SNP分型檢測(cè)，若檢測(cè)樣本中13個(gè)SNP位點(diǎn)的基因型與烤煙云煙97的完全一致，則判定該煙草樣本為烤煙云煙97；烤煙云煙97中13個(gè)SNP位點(diǎn)FP01~FP13的基因型依次TT、AA、AA、AA、AA、AA、TT、AA、AA、TT、TT、CC、TT。

6.采用如權(quán)利要求2所述引物組合鑒定烤煙云煙97的方法，其特征在于：包括以下步驟：

1）SNP位點(diǎn)多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)

以煙草樣本基因組DNA為模板，利用引物組合中的擴(kuò)增引物進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)，得PCR產(chǎn)物；

2）SAP酶反應(yīng)

用SAP酶去除PCR產(chǎn)物中剩余的dNTP和引物，得反應(yīng)產(chǎn)物；

3）單堿基延伸反應(yīng)

在反應(yīng)產(chǎn)物中加入延伸引物進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，得延伸產(chǎn)物；

4）基因型檢測(cè)及結(jié)果判定

對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)處理，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行SNP基因型檢測(cè)，若檢測(cè)樣本中SNP標(biāo)記FP01~FP13的基因型依次為T(mén)T、AA、AA、AA、AA、AA、TT、AA、AA、TT、TT、CC、TT，則判斷該煙草樣本為烤煙云煙97。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：步驟1）中多重PCR擴(kuò)增反應(yīng)為：反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液0.5μL、25mM MgCl₂ 0.4μL、25mM dNTPs 0.1μL、5U/μL PCR Enzyme 0.2μL、1μM擴(kuò)增引物的混合液1μL、10ng/μL煙草樣本基因組DNA 1μL，水補(bǔ)足至5μL；反應(yīng)條件為：95℃ 2 min；95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 1 min，45個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：步驟2）中SAP酶反應(yīng)為：在PCR產(chǎn)物中加入1.7U/μL SAP 0.3μL和10×SAP 緩沖液0.17μL，水補(bǔ)足至7μL；反應(yīng)條件為：37℃ 40min，85℃ 5min。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：步驟3）中單堿基延伸反應(yīng)為：在反應(yīng)產(chǎn)物中加入10×iPLEX緩沖液0.2μL、10×iPLEX termination mix 0.2μL、33U/μL iPLEXEnzyme 0.041μL和1μM延伸引物的混合液0.94μL，水補(bǔ)足至9μL；反應(yīng)條件為：94℃ 30s；94℃ 5s，52℃ 5s、80℃ 5s、5個(gè)循環(huán)，40個(gè)循環(huán)；72℃ 3min。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于：步驟4）中預(yù)處理為：在延伸產(chǎn)物中加入水41μL，潔凈樹(shù)脂15mg，混勻后進(jìn)行脫鹽去離子處理，離心取上清液備用；利用點(diǎn)樣儀將上清液點(diǎn)到芯片上，用MALDI-TOF質(zhì)譜儀掃描芯片，得到SNP基因型檢測(cè)結(jié)果。