[發(fā)明專利]豬支氣管上皮細(xì)胞系、制備方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710556520.4
• 申請(qǐng)日: 2017-07-10
• 公開（公告）號(hào): CN107338225B
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝星;邵國(guó)青;馮志新;甘源;龐茂達(dá);張磊;劉蓓蓓;王海燕;于巖飛;陳蓉;熊祺琰;劉茂軍;韋艷娜;華利忠;吳猛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N5/10
• 分類號(hào): C12N5/10;C12N15/85;C12R1/91
• 代理公司: 南京匯盛專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32238
• 代理人: 袁靜

本發(fā)明提供豬支氣管上皮細(xì)胞系、制備方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。豬支氣管上皮細(xì)胞系hTERT?PBEC，保藏編號(hào)為CCTCC NO：C201749。該細(xì)胞系hTERT?PBEC的制備方法，包括構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白基因和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的真核表達(dá)載體pEGFP?hTERT；利用Lipofectamin 3000將真核表達(dá)載體pEGFP?hTERT轉(zhuǎn)染豬原代支氣管上皮細(xì)胞，通過G418篩選得到豬支氣管上皮細(xì)胞系hTERT?PBEC。本發(fā)明通過巧妙的方法，顯著提高了篩選效率，得到的豬支氣管上皮細(xì)胞系，能夠穩(wěn)定傳代至60代以上，且保留有原代細(xì)胞的特性，能夠應(yīng)用于研究豬呼吸道病原感染致病機(jī)理中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及豬支氣管上皮細(xì)胞系、制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬傳染性疾病在世界范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)及人類都是一主要的健康威脅，目前對(duì)豬的疾病研究早已成為獸醫(yī)學(xué)研究的一個(gè)重點(diǎn)。對(duì)豬而言，傳染性疾病多發(fā)于消化道和呼吸道，而呼吸道疾病是一年四季的常發(fā)病，對(duì)豬的危害最大。目前多種病毒、細(xì)菌、寄生蟲等微生物被認(rèn)為是可引起豬呼吸系統(tǒng)疾病的病原，如豬場(chǎng)常見的豬肺炎支原體、豬藍(lán)耳病、2型圓環(huán)病毒、豬流感病毒等。然而相較于人類和禽類，豬類病原的研究還相對(duì)比較薄弱，特別是這些病原在豬呼吸系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生中如何產(chǎn)生作用，致病機(jī)理如何，尚不明確。

目前，對(duì)豬類呼吸道病原的研究主要集中在豬體內(nèi)感染，尚缺乏合適的宿主細(xì)胞模型，例如支氣管上皮細(xì)胞系。由于原代支氣管上皮細(xì)胞在體外培養(yǎng)難以長(zhǎng)期傳代生存，在當(dāng)前的細(xì)胞培養(yǎng)條件下，原代上皮細(xì)胞在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上的應(yīng)用受限主要由于其有限的增殖特性，既在于其上皮相關(guān)特性在幾代內(nèi)就會(huì)消失也在于分離組織的量的有限性。和大多數(shù)哺乳動(dòng)物體細(xì)胞一樣，這些原代細(xì)胞生命有限并且將停止分裂，在一定數(shù)目的細(xì)胞分裂后隨即開始衰老。所有的這些固有的缺點(diǎn)都急需制備獲得可延長(zhǎng)壽命的永生化的細(xì)胞系，因此制備永生化的豬支氣管上皮細(xì)胞具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供豬支氣管上皮細(xì)胞系，能夠穩(wěn)定傳代至60代以上，且保留有原代細(xì)胞的特性。

本發(fā)明的另一目的是提供該豬支氣管上皮細(xì)胞系的制備方法，該方法巧妙、顯著提高了篩選效率。

本發(fā)明的再一目的是提供所述豬支氣管上皮細(xì)胞系hTERT-PBEC在研究豬呼吸道病原感染致病機(jī)理中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

豬支氣管上皮細(xì)胞系hTERT-PBEC，保藏編號(hào)為CCTCC NO：C201749。

本發(fā)明還提供豬支氣管上皮細(xì)胞系hTERT-PBEC的制備方法，包括如下步驟：

(1)構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白基因和人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的真核表達(dá)載體pEGFP-hTERT；

(2)利用Lipofectamin 3000將真核表達(dá)載體pEGFP-hTERT轉(zhuǎn)染豬原代支氣管上皮細(xì)胞，通過G418篩選得到豬支氣管上皮細(xì)胞系hTERT-PBEC。

在本發(fā)明中，所述真核表達(dá)載體pEGFP-hTERT是將人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因插入熒光真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP后獲得的。

本發(fā)明還提供所述豬支氣管上皮細(xì)胞系hTERT-PBEC在研究豬呼吸道病原感染致病機(jī)理中的應(yīng)用。

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)細(xì)胞“永生化”是指細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后自發(fā)或在外界因素的影響下脫離增殖衰老，最終獲得無(wú)限增殖能力的過程。