[發(fā)明專利]一種催化合成肌肽的氨肽酶及其制備方法和應(yīng)用

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• 申請日: 2017-07-10
• 公開（公告）號: CN107217048A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃科學(xué);祝俊;吳鋒;王峰峰;張超;華俊國;余玉奎;徐飛
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇誠信藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N9/48
• 分類號: C12N9/48;C12N15/57;C12P17/10
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• 代理人: 暫無信息

1.一種催化合成肌肽的氨肽酶，所述氨肽酶為SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述催化合成肌肽的氨肽酶，其特征在于，所示氨肽酶來源于體外重組構(gòu)建的基因工程菌株；所述基因工程菌株為大腸桿菌、畢氏酵母、枯草芽孢桿菌。

3.一種編碼權(quán)利要求1所述的氨肽酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一種權(quán)利要求1所述的氨肽酶的制備方法，包括如下步驟：

1）首先構(gòu)建氨肽酶的基因工程菌株，將權(quán)利要求3所述的核苷酸序列經(jīng)酶切重組到表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中；

2）取原種菌種在YPD平板上劃線，30℃，倒置培養(yǎng)40h；

3）在平板上挑取單菌落轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基中，30℃，振蕩培養(yǎng)24小時，OD600增長至4～5；

4）以10%的接種量接種至液體培養(yǎng)基的搖瓶中，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)，約24小時后OD600生長至12左右；

5）將發(fā)酵培養(yǎng)基配制好后，轉(zhuǎn)移至發(fā)酵罐中，121℃滅菌30min；降溫至30±2℃，使用氨水調(diào)節(jié)pH值至5.0；

6）將培養(yǎng)好的菌種液接種至發(fā)酵罐，接種量5%；

7）根據(jù)溶氧調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速和通氣，保持溶氧在30%以上，誘導(dǎo)發(fā)酵96小時后，放罐；

8）離心，收集清液；

9）將清液超濾濃縮后凍干，得到合成肌肽用氨肽酶的凍干粉。

5.采用權(quán)利要求1所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，包括如下步驟：

1）β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽合成

1.1）向反應(yīng)釜中加入甲醇，控溫0～20℃將氯化亞砜滴入其中，滴加完畢，加入β-丙氨酸，30～60℃保溫攪拌；

1.2）30～50℃減壓，真空度≤-0.09MPa，濃縮，濃縮至無餾分流出，得β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽；

2）酶催化反應(yīng)

2.1 向反應(yīng)釜中加入L-組氨酸、去離子水、上述反應(yīng)制備的β-丙氨酸甲酯鹽酸鹽；

2.2 在15～45℃溫度下，用堿性溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0～9.0；

2.3 加入如權(quán)利要求4所述制備的氨肽酶，該氨肽酶的用量為反應(yīng)液體積的1%～3%，25～45℃攪拌反應(yīng)，反應(yīng)過程中用堿性溶液控制反應(yīng)體系pH值在7.0～9.0；

3）肌肽粗品制備

3.1 反應(yīng)完畢，放料，料液離心除去不溶物，收集濾液；

3.2 將得到的濾液通過超濾機(jī)進(jìn)行超濾，收集超濾透析液；

3.3 將得到的超濾透析液通過納濾機(jī)進(jìn)行納濾，收集納濾濃縮液；

3.4 將納濾濃縮液上離子樹脂柱，樹脂柱的徑高比為0.05～0.2，上樣pH值為5.0～7.0；

3.5 用純化水沖洗樹脂柱；

3.6 用1%～5%的氨水洗脫解吸附樹脂柱，收集茚三酮顯色部分洗脫液；

3.7 將收集的洗脫液50～80℃減壓，真空度≤-0.09MPa，濃縮肌肽含量至20～40%；

3.8 加入析晶溶劑，0～25℃，攪拌析晶10～24h；

3.9 析晶完畢，放料離心，30～50℃，減壓，真空度≤-0.09MPa，干燥6～8h，得肌肽粗品。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，其特征在于：所述的析晶溶劑為甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮中的一種。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，其特征在于：所述的超濾機(jī)的濾膜孔徑為8000～10000道爾頓。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的氨肽酶催化合成肌肽的方法，其特征在于：所述的納濾機(jī)的濾膜孔徑為200～300道爾頓。