[發(fā)明專利]一種制備B區(qū)缺失的成熟人凝血因子Ⅷ的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710554321.X
• 申請(qǐng)日: 2017-07-10
• 公開（公告）號(hào): CN107142278A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹杰超;李德山;王文飛;袁清艷;鄭琦;黃濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N5/10;C07K14/755;A61K38/37;A61P7/04
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，涉及人凝血因子Ⅷ重鏈FⅧ_H和輕鏈FⅧ_L表達(dá)載體的構(gòu)建、哺乳動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染、FⅧ_H和FⅧ_L高效表達(dá)細(xì)胞株的篩選和鑒定、B區(qū)缺失的成熟人凝血因子Ⅷ的制備、活性檢定及在藥學(xué)上的應(yīng)用。

背景技術(shù)

血友病是一類由于缺乏某種凝血因子從而致使患者發(fā)生凝血功能障礙的疾病，臨床上分為三個(gè)類型：血友病A、血友病B以及凝血因子XI缺乏癥。其中血友病A多見，大概占總數(shù)的80％。該類疾病是由于血液中的凝血因子Ⅷ缺乏從而致使患者發(fā)生嚴(yán)重凝血障礙，是X 染色體連鎖的隱性遺傳性疾病。

凝血因子Ⅷ基因在X染色體Xq28處，其基因全長(zhǎng)為186kb，該編碼序列為當(dāng)時(shí)已知的最大的基因。成熟FⅧ蛋白由三種結(jié)構(gòu)域組成。A結(jié)構(gòu)域：含有三個(gè)片段，在氨基端出現(xiàn)兩次，為A1、A2，在羧基端出現(xiàn)一次，為A3。每個(gè)A片段均約由330個(gè)氨基酸組成，有30％的同源性，與血漿銅藍(lán)蛋白同源性頗高。B結(jié)構(gòu)域：只有一個(gè)中間片段，約由980個(gè)氨基酸組成，是高度糖基化的區(qū)域，對(duì)FⅧ的合成與分泌、蛋白清除具有重要意義，但其在FⅧ的活化過程被完全清除。C結(jié)構(gòu)域：含有兩個(gè)片段，在羧基端出現(xiàn)兩次，為C1、C2，每個(gè)C結(jié)構(gòu)域由約150個(gè)氨基酸組成。其排列順序是A1-A2-B-A3-C1-C2，其中A1-A2-B構(gòu)成凝血因子Ⅷ的重鏈(FⅧ_H)，A3-C1-C2構(gòu)成凝血因子Ⅷ的輕鏈(FⅧ_L)。

自1984年成功克隆FⅧ的cDNA以來，人FⅧ的重組表達(dá)就成為研究的熱點(diǎn)。1989年第一次報(bào)道使用重組人全長(zhǎng)FⅧ(rhFⅧ)制劑成功的治療了一位嚴(yán)重型A血友病患者的事例。 1992年FDA正式批準(zhǔn)第一代野生型全長(zhǎng)rhFⅧ應(yīng)用于血友病A的治療。2000年拜耳公司研制的新型rhFⅧ藥物——拜科奇得到FDA和EMEA的批準(zhǔn)可用于治療血友病A。直到2007 年SFDA才批準(zhǔn)該藥物能在我國(guó)上市，成為國(guó)內(nèi)第一個(gè)上市的rhFⅧ產(chǎn)品。但第一代野生型全長(zhǎng)rhFⅧ制劑中仍然含有大量血漿來源蛋白質(zhì)，因而其穩(wěn)定性、活性及成本等方面不能滿足市場(chǎng)的需要。這促使科研工作者努力開發(fā)新一代的重組FⅧ制品。

FⅧ的B結(jié)構(gòu)域約占完整分子的40％，該區(qū)域的功能還未徹底研究清楚。但自從發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)B結(jié)構(gòu)域缺失的BDD-rFⅧ(B-domain deleted recombinant factorⅧ，BDD-rFⅧ)由于 mRNA長(zhǎng)度減少，其轉(zhuǎn)錄活性提高了17倍，蛋白表達(dá)量和活性明顯高于全長(zhǎng)rhFⅧ，且研究表明B結(jié)構(gòu)域缺失不影響體內(nèi)或體外的促凝活性，因此B結(jié)構(gòu)域缺失的rFⅧ成為新一代rhF Ⅷ的重點(diǎn)研究方向。本發(fā)明提供了一種制備B區(qū)缺失的成熟人凝血因子Ⅷ的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供兩種分別克隆有rhFⅧ_H和rhFⅧ_L基因的載體，利用該載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系CHO-KⅠSV中高效表達(dá)rhFⅧ_H和rhFⅧ_L蛋白；提供了一種制備B區(qū)缺失的成熟人凝血因子Ⅷ的方法及其藥學(xué)應(yīng)用。

在第一方面，本發(fā)明提供了一種獲得高效表達(dá)rhFⅧ_H和rhFⅧ_L的表達(dá)載體的方法。

首先，通過對(duì)CHO細(xì)胞密碼子偏愛性的分析，發(fā)現(xiàn)FⅧ_H和FⅧ_L基因中氨基酸密碼子的偏愛性與CHO細(xì)胞有較大差異，為了提高基因的表達(dá)效率，將FⅧ_H和FⅧ_L基因中的氨基酸密碼子改造為CHO細(xì)胞高偏愛性密碼子，通過人工合成的方法獲得FⅧ_H和FⅧ_L基因。FⅧ_H(不包含B結(jié)構(gòu)域)基因2220bp(位于FⅧ基因229-2448bp)，F(xiàn)Ⅷ_L基因2052bp(位于FⅧ基因5173-7224bp)。

將測(cè)序正確的FⅧ_H和FⅧ_L依次克隆至真核表達(dá)Pklight載體、IRES-EGFP載體和Pee12.4 載體中，然后利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)入CHO-KⅠSV細(xì)胞，以綠色熒光蛋白(EGFP)作為報(bào)告基因，通過谷氨酰胺合成酶(GS)加壓和流式細(xì)胞儀篩選得到分別穩(wěn)定表達(dá)rhFⅧ_H和rhFⅧ_L蛋白的CHO-KⅠSV細(xì)胞系。