[發(fā)明專利]一種旱稻孢囊線蟲LAMP快速檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710554029.8
• 申請日: 2017-07-09
• 公開（公告）號(hào): CN107142329A
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 彭煥;彭德良;巧巧·吳泰;黃文坤;孔令安;賀文婷;丁中
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京兆君聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11333
• 代理人: 胡敬紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種旱稻孢囊線蟲LAMP快速檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

旱稻孢囊線蟲(Heterodera elachista)是一種主要侵染水稻的植物寄生線蟲，最早于日本櫪木縣的稻田中被發(fā)現(xiàn)(Ohshima Y.Heterodera elachista n sp.an upland rice cyst nematode from Japan[J].Japanese Journal of Nematology，1974(4):51-56.)。目前該線蟲病害在湖南省多個(gè)縣(市)丘陵地帶的水稻田首次發(fā)現(xiàn)(Ding Z，Namphueng J，He X F.First report of the cyst Nematode(Heterodera elachista)on rice in Hunan province,China[J].Plant Disease,2012,96(1):151)。旱稻孢囊線蟲一般寄生在寄主根部，其危害癥狀與水肥失調(diào)引起的癥狀極其相似，除吸收寄主的營養(yǎng)和對植物根部造成傷害外，還降低水稻對水的利用效率，繼而影響寄主的生長和發(fā)育(丁中,Namphueng Janthathang,何旭峰等.旱稻孢囊線蟲生活史及侵染特性[J].中國水稻科學(xué),2012,26(6):746-750)，造成水稻減產(chǎn)7％～19％(Bridge J，Luc M，Plowright R A.Plant Parasitic Nematodes in Tropical and Subtropical Agriculture[M].Wallingford：CAB International,1990:69–108)。目前旱稻孢囊線蟲病主要發(fā)生在長江中下游水稻種植區(qū)，且危害日趨嚴(yán)重，有可能成為我國的水稻生產(chǎn)中的又一嚴(yán)重威脅，同時(shí)該線蟲病害的發(fā)生分布還不十分的明確，對該線蟲做出快速準(zhǔn)確的鑒定是當(dāng)前麥類作物生產(chǎn)急需解決的問題。

旱稻孢囊線蟲屬于Cyperi群組，在形態(tài)上與H.oryzae、H.sacchari和H.leuceilyma非常相近。其與H.sacchari和H.leuceilyma最明顯的區(qū)別是在孢囊細(xì)長的下橋上缺乏指形的投影，而與H.oryzae相比，孢囊略小，二齡幼蟲長度略短。目前旱稻孢囊線蟲的鑒定大部分仍然依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，但是由于形態(tài)學(xué)鑒定耗時(shí)、需要很熟練的技術(shù)作為基礎(chǔ)，并且需要專門從事分類的人員來完成，這些原因使傳統(tǒng)的鑒定方法時(shí)常存在一定誤差并且不適用于大規(guī)模的樣品檢測。

近年來，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，PCR等快速檢測技術(shù)已經(jīng)廣泛的運(yùn)用到植物線蟲的快速檢測和鑒定中。目前運(yùn)用到孢囊線蟲的檢測技術(shù)主要包括ITS-RFLP,PCR，real time PCR等。

Amiri等通過對H.betae、H.ciceri、H.glycines和H.medicaginis、H.schachtii、H.trifolii的ITS序列進(jìn)行分析，篩選出特異性引物SHF6，將此引物與AB28(或rDNA2)引物結(jié)合，構(gòu)建了甜菜孢囊線蟲一步雙重PCR的檢測方法(Amiri S.,Subbotin S.A.,Moens M.,An efficient method for identification of the Heterodera schachtii sensu stricto group using PCR with specific primers.Nematol.medit.2001,29:241-246)。Subbotin S A,Peng D L,Moens M.運(yùn)用雙重PCR檢測大豆孢囊線蟲的方法，在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)運(yùn)用通用引物D3A和D3B以及特異性引物GlyF1和rDNA2，從52個(gè)大豆孢囊線蟲群體中均擴(kuò)增出兩個(gè)DNA片斷(181bp and 345bp)，檢測的敏感度高達(dá)單個(gè)孢囊、單頭二齡幼蟲的微量DNA(Subboton S.A.,Peng D L,Moens M.,A rapid method for the identification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines using duplex PCR.Nematology 2001,vol.3(4):365-371)。