[發(fā)明專利]一種動態(tài)調(diào)控3?羥基丙酸合成的工程菌構(gòu)建方法

在審

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• 申請日: 2017-07-09
• 公開（公告）號: CN107400652A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉長莉;李玉花;徐啟江;劉曦;王宏偉;常樂
• 申請（專利權(quán)）人: 東北林業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12R1/19
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明設(shè)計(jì)一種動態(tài)調(diào)控3-羥基丙酸(3-Hydroxypropionic acid,3HP)合成的工程菌構(gòu)建方法，具體涉及了基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

隨著石油儲量的枯竭和環(huán)境的惡化，世界各國都在致力于各種可再生能源的研究和開發(fā)。3HP是美國能源部提出的可再生生物質(zhì)中12種增值平臺化合物之一。3HP分子含有兩個(gè)具有不同性質(zhì)的官能團(tuán)-羥基和羧基，使其成為許多光學(xué)活性物質(zhì)的前體，如丙烯酸，1,3-丙二醇，3-羥基丙醛和丙二酸等。該化合物在化工行業(yè)的應(yīng)用亦是多樣化的，它用作聚合物涂料，金屬潤滑劑和紡織品抗靜電劑等。此外，3HP是用在環(huán)化或聚合反應(yīng)中生產(chǎn)丙內(nèi)酯、聚酯和低聚物的初始材料，其中由3HP的自縮合產(chǎn)生的聚合物聚3HP酯具有良好的生物相容性和生物降解性，并可用于制造手術(shù)產(chǎn)品和藥物釋放材料。

傳統(tǒng)的3HP生產(chǎn)一般通過化學(xué)方法合成，如β-溴丙酸水解法、2-氰基乙醇酸堿法、3-羥基丙醛氧化法和利用丙烯酸及β-羥基腈合成法等。然而，化學(xué)合成3HP具有耗能大、成本高、分離度低、對環(huán)境污染大等問題，在商業(yè)化生產(chǎn)上不具有可行性。3HP的生物生產(chǎn)的研究始于21世紀(jì)初，在不斷研究中構(gòu)建了多株重組大腸桿菌(Escherichia coli)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，并以葡萄糖或甘油作為原料的生物合成途徑用于各種代謝工程微生物的生產(chǎn)當(dāng)中。其中大腸桿菌由于遺傳背景清楚、重組子穩(wěn)定、生長繁殖快等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛研究利用。

我們前期研究3HP合成中發(fā)現(xiàn)，乙酸CoA轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰CoA效率低，限制下游產(chǎn)物積累。為了提高丙二酸單酰CoA合成效率，過表達(dá)acc，但是隨著誘導(dǎo)劑IPTG濃度增加，卻發(fā)現(xiàn)最終產(chǎn)物濃度逐漸減少。為了探尋其減少原因，我們分別將來自大腸桿菌和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的acc基因(即 acc_E和acc_S)以及不含acc基因的pE7a質(zhì)粒分別在E.coli中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)現(xiàn)雖然高濃度IPTG對不合成丙二酸單酰CoA的對照菌體濃度有一定影響，但與對照相比，acc_E和acc_S的表達(dá)對宿主菌生長產(chǎn)生了明顯的抑制。我們的研究結(jié)果證實(shí)了多篇文獻(xiàn)報(bào)道的高濃度丙二酸單酰CoA抑制菌體生長的現(xiàn)象。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的轉(zhuǎn)錄因子FapR具有與丙二酸單酰CoA結(jié)合，影響RNA聚合酶調(diào)控啟動子下游基因轉(zhuǎn)錄速率的特性。利用FapR與丙二酸單酰CoA相互作用這一特性，設(shè)計(jì)負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路來控制丙二酸單酰CoA的合成與轉(zhuǎn)化中兩個(gè)關(guān)鍵酶：乙酰CoA羧化酶與丙二酸單酰CoA還原酶，解決菌體毒害和3HP產(chǎn)量偏低的問題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于運(yùn)用合成生物學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)了一種動態(tài)調(diào)控3HP合成的工程菌構(gòu)建方法。該方法利用生物傳感器動態(tài)調(diào)控3HP的生物合成，能夠降低生產(chǎn)成本、提高濃度和產(chǎn)量。

大量研究表明，過表達(dá)acc可提高丙二酸單酰CoA的濃度并改善3HP的產(chǎn)生；另一方面，acc的過表達(dá)對細(xì)胞有毒害作用。本發(fā)明為了增強(qiáng)丙二酸單酰 CoA供應(yīng)，同時(shí)減輕由acc過表達(dá)引起的細(xì)胞毒性，基于來自革蘭氏陽性細(xì)菌枯草芽孢桿菌天然存在的丙二酸單酰CoA應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子FapR設(shè)計(jì)了生物傳感器，并用它負(fù)面調(diào)節(jié)acc表達(dá)，調(diào)控3HP的生物合成。當(dāng)過表達(dá)重組質(zhì)粒pE7a-acc 時(shí)，工程菌中積累過量丙二酸單酰CoA，此時(shí)生物傳感器將打開重組質(zhì)粒pBFR1k-lacI-FapR中l(wèi)acI的表達(dá)，通過丙二酸單酰CoA與FapR的結(jié)合引發(fā)FapR 構(gòu)象變化，導(dǎo)致FapR-DNA復(fù)合物解離，從而反過來下調(diào)acc，降低丙二酸單酰 CoA合成速率，減少菌體毒害。后續(xù)表達(dá)重組質(zhì)粒pS2c-mcr，最終促進(jìn)3HP的合成。

2017年6月7日將E.coli 3HP-0菌種保藏并登記入冊到中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所)，菌種保藏編號為CGMCC No.14224，分類命名為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)，該菌株的存活性經(jīng)保藏中心于6月7日檢測結(jié)果為存活。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的,本發(fā)明提供如下技術(shù)方案；

一種動態(tài)調(diào)控3HP合成的工程菌構(gòu)建方法，其特征在于該方法按照以下步驟進(jìn)行：

(1)純化擴(kuò)增出大腸桿菌中的accDA基因和accBC基因，構(gòu)建得到重組質(zhì)粒pE7a-acc，通過過表達(dá)acc合成中間產(chǎn)物丙二酸單酰CoA；