[發明專利]一種動態促進3?羥基丙酸高產的生物傳感器構建方法

在審

• 申請號: 201710553938.X
• 申請日: 2017-07-09
• 公開（公告）號: CN107400651A
• 公開（公告）日: 2017-11-28
• 發明（設計）人: 劉長莉;隋廣超;徐啟江;楊洪一;張杰;常樂
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.動態促進3-羥基丙酸(3HP)高產的生物傳感器所在的工程菌株Escherichia coli 3HP-0，其保藏編號為CGMCC No.14224。

2.一種動態促進3HP高產的生物傳感器的方法，其特征在于能根據中間產物丙二酸單酰CoA濃度，動態調控丙二酸單酰CoA合成的乙酰CoA羧化酶基因(acc)和丙二酸單酰CoA轉化為3HP的丙二酸單酰CoA還原酶基因(mcr)的轉錄，進而解決丙二酸單酰CoA對菌體毒害和P3HP產量偏低的問題。

3.權利要求2所述的傳感器，其特征在于含有枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的轉錄因子FapR和受FapR調控的啟動子基因序列(P_FR1)，還含有大腸桿菌(Escherichia coli)的乙酰CoA羧化酶基因(acc)和乳糖操縱子調節基因(lacI)、嗜熱光全綠絲菌(Chloroflexus aurantiacus)的丙二酸單酰CoA還原酶基因(mcr)。

4.權利要求2所的生物傳感器，構建方法按以下的步驟進行：

一、含動態促進3HP高產的生物傳感器工程菌的構建：

構建將乙酰CoA轉化為丙二酸單酰CoA的質粒pE7a-acc；同時構建將丙二酸單酰CoA轉化為3HP的質粒pS2c-mcr-PrpE；以及由轉錄因子FapR負反饋調控丙二酸單酰CoA生物傳感器質粒pBFR1k-lacI-8FapR。通過電轉化轉入E.coli BL21(DE3)感受態細胞中，獲得具有動態促進3HP高產的生物傳感器能力的工程菌，置于-40℃保存；

二、含動態促進3HP高產的生物傳感器工程菌的活化培養：

已構建的生物傳感器動態合成3HP工程菌在補充有適當抗生素的LB培養基中，發酵溫度28℃-37℃，100rpm-200rpm培養；將過夜培養在LB上的培養物以1％-2％(v/v)接種到新鮮LB培養基中，將該工程菌按照上述步驟再次進行活化；

三、含動態促進3HP高產的生物傳感器工程菌的誘導培養：

將已活化的產3HP工程菌，以1％-2％(v/v)接種M9基本培養基發酵培養，待菌液OD₆₀₀達到0.6-0.8時，使用0.2mM-0.6mM IPTG、0.001％-0.005％L-Arabinose及200nM-600nM aTc對工程菌進行誘導培養48h，分別通過分光光度計和液相色譜測定3HP的OD和產量。

5.一種動態促進3HP高產的生物傳感器構建方法，其特征在于權利要求4中的步驟三使用0.1mM-0.4mM和0.6mM-1mM IPTG誘導3HP合成。

6.一種動態促進3HP高產的生物傳感器構建方法，其特征在于權利要求4中的步驟三使用0-0.001％和0.1％-1％L-Arabinose誘導誘導3HP合成。