[發(fā)明專利]一種靶向IGF?IR基因的sgRNA及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710552226.6
• 申請(qǐng)日: 2017-07-07
• 公開（公告）號(hào): CN107190006A
• 公開（公告）日: 2017-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董志珍;姚敏;王理;姚登福;鄭文杰;蔡胤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)附屬醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/867;C12N15/90
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所11569
• 代理人: 王加貴

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種靶向IGF-IR基因的sgRNA及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

新近研究發(fā)現(xiàn)IGF信號(hào)通路中關(guān)鍵信號(hào)分子IGF-IR，具有癌胚性，與肝癌進(jìn)展間存在密切關(guān)系，但其基因轉(zhuǎn)錄或活化干預(yù)是否影響生物學(xué)功能與治療價(jià)值尚不清楚。IGF家族(IGFs)由IGF-I、IGF-II、IGF-IR、IGF-IIR以及6種結(jié)合蛋白組成。IGFs與胰島素有相似的分子結(jié)構(gòu)，它的功能包括促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化和各種類型細(xì)胞的生存以及保持細(xì)胞的各種功能，其在體內(nèi)生長(zhǎng)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。IGF-II的主要功能是產(chǎn)生生長(zhǎng)因子，它在許多生長(zhǎng)發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，并且在生長(zhǎng)發(fā)育過程中以及成年后都廣泛表達(dá)。愈來愈多的證據(jù)表明IGF-I和II及其酪氨酸激酶受體，參與HCC發(fā)生與發(fā)展。聯(lián)合靶向IGF-IR和mTOR通路作為一種新型治療方法，將最大限度的發(fā)揮抗腫瘤作用，且防止耐藥機(jī)制早期發(fā)展。

介于IGF-IR在肝癌形成、惡性轉(zhuǎn)化及侵襲轉(zhuǎn)移過程中都扮演著重要角色，阻斷該信號(hào)通路，有望使癌細(xì)胞生長(zhǎng)受抑、誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生凋亡或增加對(duì)放、化療敏感性，表明酪氨酸激酶受體IGF-IR已成為小分子酪氨酸激酶抑制劑、抗體藥物設(shè)計(jì)及核酸干預(yù)的重要靶點(diǎn)。

新近一項(xiàng)CRISPR/Cas9基因敲除新技術(shù)，突破物種限制可敲除任何基因。CRISPR RNA是原核生物中的調(diào)控RNA，用以抵御病毒和質(zhì)粒的入侵，在II型CRISPR系統(tǒng)中，其形成的復(fù)合物首先特異識(shí)別基因組序列，然后Cas9核酸內(nèi)切酶切斷目的基因雙鏈。Cas9以序列特異性方式綁定和切割DNA能力非常強(qiáng)大，近年被廣泛應(yīng)用于各種基因組的研究包括HBV基因。尚未見定向剪接肝癌IGF-IR基因的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種特異靶向IGF-IR基因的sgRNA導(dǎo)向序列。該sgRNA導(dǎo)向序列可以用于敲除肝癌細(xì)胞中IGF-IR基因，使其轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，使肝癌HepG2細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力下降。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種靶向IGF-IR基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，能識(shí)別人肝癌細(xì)胞染色體上IGF-IR基因，和與Cas9核酸酶結(jié)合的骨架RNA片段。

本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供由編碼所述靶向IGF-IR基因的sgRNA的DNA分子。

本發(fā)明第三個(gè)目的是提供上述sgRNA在特異識(shí)別和靶向修飾人肝癌細(xì)胞IGF-IR基因中的應(yīng)用。所述人肝癌細(xì)胞IGF-IR基因，其基因組序列是NCBI NM000875中的區(qū)域。

本發(fā)明第四個(gè)目的是提供上述sgRNA在構(gòu)建人肝癌細(xì)胞IGF-IR基因突變庫(kù)中的應(yīng)用。所述人肝癌細(xì)胞IGF-IR基因，其基因組序列是NCBI NM000875中的區(qū)域。

現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供了一種特異靶向識(shí)別IGF-IR基因的sgRNA，并提供了該sgRNA的編碼DNA片段，應(yīng)用Crispr/cas9-sgRNA慢病毒載體系統(tǒng)，在細(xì)胞水平上成功對(duì)人肝癌細(xì)胞IGF-IR基因進(jìn)行敲除或修飾，使肝癌細(xì)胞IGF-IR基因轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，使肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力下降，為肝癌治療提供有效新方法，具有臨床應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為嘌呤霉素篩選經(jīng)cas9病毒感染的細(xì)胞。

圖2為二次感染帶熒光的sgRNA病毒，其中，A：普通光鏡圖；B：同一視野熒光顯微鏡圖；A&B1-3為sgRNA(+)病毒感染組，A&B4為sgRNA(-)病毒感染組。

圖3為二次感染帶熒光的sgRNA病毒感染效率直方圖；sgRNA1-3為sgRNA(+)病毒感染組。

圖4為蛋白水平驗(yàn)證IGF-IR基因敲除效率Western blotting圖。

圖5為蛋白水平驗(yàn)證IGF-IR基因敲除效率Quantity One(Bio-Rad)軟件定量條帶灰度強(qiáng)度，*：P<0.05。

圖6為敲除IGF-IR基因抑制肝癌細(xì)胞增殖活性影響的線性圖，其中，*P<0.01，**P>0.05。

圖7為敲除IGF-IR基因抑制肝癌細(xì)胞增殖活性影響的直方圖，其中，*P<0.01，**P>0.05。