[發明專利]靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞、制備方法及應用

在審

• 申請號: 201710548509.3
• 申請日: 2017-07-07
• 公開（公告）號: CN107287164A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 汝昆;陳樹英;宋鴿;藺亞妮;魏萬旭
• 申請（專利權）人: 青島協和華美醫學診斷技術有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K35/17;A61P35/00
• 代理公司: 青島聯信知識產權代理事務所(普通合伙)37227
• 代理人: 王月玲,段秀瑛

1.靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞，表面表達靶向CD19的嵌合抗原受體基因，其特征在于，

所述靶向CD19的嵌合抗原受體基因由CD19的單鏈抗體CD19ScFv、CD8的鉸鏈區和跨膜區、CD28的胞內信號結構域、4-1BB的胞內信號結構域以及CD3ζ的胞內信號結構域串聯構成，其堿基序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根據權利要求1所述的靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞，其特征在于，

CD19的單鏈抗體CD19ScFv序列由鼠抗人CD19抗體克隆FMC63的重鏈和輕鏈可變區序列經過密碼子優化而得，其堿基序列如SEQ ID NO:1所示。

3.權利要求1或2所述的靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)CD19-CAR慢病毒載體的構建

在上述靶向CD19的嵌合抗原受體基因序列兩端添加酶切位點，與慢病毒表達載體Plv-EF1a雙酶切，回收DNA片段，連接，轉化，挑取單克隆，提取質粒，經過酶切和測序鑒定，得CD19-CAR慢病毒載體Plv-EF1a-CD19ScFv；

(2)慢病毒的制備

提取慢病毒骨架質粒Plv-EF1a，慢病毒表達質粒Plv-EF1a-CD19ScFv,輔助質粒psPAX2和pMD2.G，測定質粒濃度，配制轉染體系，轉染HEK293T/17細胞，分離得慢病毒濃縮液；

(3)T細胞的分離和培養

取健康外周血，分離淋巴細胞，刺激培養24-48h。

(4)T細胞的感染和擴增

將上述刺激培養的T細胞接種到培養板，加入步驟(2)的慢病毒濃縮液，感染8-12h，獲得靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞。

4.根據權利要求3所述的靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，

在上述靶向CD19的嵌合抗原受體基因序列兩端添加酶切位點BamH1和Sal1,與慢病毒表達載體Plv-EF1a用限制性內切酶BamH1和Sal1進行雙酶切。

5.根據權利要求3所述的靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，

所述配制轉染體系，轉染HEK293T/17細胞，分離得慢病毒濃縮液的具體操作為：

取細胞狀態良好的HEK293T/17細胞培養，將表達質粒Plv-EF1a或Plv-EF1a-CD19ScFv，輔助質粒psPAX2和pMD2.G以9:6:3的質量比與LipoFilter轉染試劑以及無血清DMEM培養基配制轉染體系，孵育后共轉染HEK293T/17細胞，12h后更換培養液；

分別在轉染換液后24h、48h時收集病毒上清，離心，過濾，過濾后的病毒液超速離心，棄掉上清，沉淀用無血清培養液重懸，得慢病毒濃縮液。

6.根據權利要求3所述的靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，

所述T細胞的分離和培養的具體操作為：

取健康外周血，離心后留自體血漿備用，剩余血細胞用等體積生理鹽水稀釋，加入到淋巴細胞分離液的上層，離心，吸取中間白膜層細胞，加入生理鹽水洗滌，離心，得分離的淋巴細胞；

分離后的淋巴細胞用T淋巴細胞培養液加2％體積的自體血漿重懸，并調整細胞密度，接種于濃度為5ug/ml的CD3和CD28抗體包被的培養板中，刺激培養24h-48h。

7.根據權利要求6所述的靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞的制備方法，其特征在于，

含有2％體積的自體血漿的培養板中補充終濃度為500U/ml的重組人白介素2，25ng/ml的重組人白介素7和50ng/ml的重組人白介素15。

8.權利要求1或2所述的靶向CD19的嵌合抗原受體T細胞在制備抗B細胞惡性腫瘤藥物中的應用。