[發(fā)明專利]一種溶解石蠟組織切片的方法及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710548024.4
• 申請日: 2017-07-06
• 公開（公告）號: CN107271239A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃彥欽;彭佳萍;葛維挺
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 杭州求是專利事務(wù)所有限公司33200
• 代理人: 趙杭麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。涉及生物組織石蠟樣本處理，尤其涉及一種溶解石蠟組織切片的方法，是一種溶解消化石蠟包埋組織切片的方法，特別適用于生物組織石蠟樣本提取核酸物質(zhì)時(shí)使用。

背景技術(shù)

腫瘤基因檢測是當(dāng)前熱門的臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域，通過對腫瘤組織DNA、RNA、miRNA等核酸物質(zhì)檢測可獲得腫瘤的分子特征，從而預(yù)判腫瘤患者復(fù)發(fā)生存、治療反應(yīng)等臨床特征。石蠟包埋腫瘤組織切片是最常用的腫瘤基因檢測樣本，如檢測肺癌石蠟包埋組織DNA的EGFR突變可判斷酪氨酸激酶抑制劑的療效，檢測乳腺癌21個(gè)基因的RNA表達(dá)量可判斷是否需要術(shù)后化療。在這些腫瘤基因檢測中，一般需要從石蠟包埋組織切片中提取DNA或RNA進(jìn)行檢測。

石蠟包埋是常溫長期保存組織蛋白和核酸分子的經(jīng)典方法，幾乎所有醫(yī)療機(jī)構(gòu)均會采用石蠟包埋方法保存腫瘤組織。在石蠟包埋過程中，新鮮組織經(jīng)過有機(jī)溶劑固定和逐步脫水，組織中水的成份被石蠟油替代，從而使生物分子得到完整保存。而在石蠟包埋組織提取DNA或RNA的過程中，則必須將組織中的石蠟成份溶解出，由水來替代，稱為“脫蠟”。脫蠟的組織一般采用蛋白酶進(jìn)行溶解消化，以釋放出DNA和RNA等核酸物質(zhì)。脫蠟和溶解的過程，一般由有機(jī)溶劑二甲苯和蛋白酶K來完成。

一般的石蠟切片組織要求厚度在5-6微米之間，薄的切片有利于二甲苯溶劑的滲透和蛋白酶K的消化，從而使提取更加徹底。但是在實(shí)際操作中，石蠟切片的厚度在不同醫(yī)療機(jī)構(gòu)及不同切片操作員切取時(shí)會有較大差異。特別在進(jìn)行一些核酸用量較大的基因檢測如乳腺癌21基因表達(dá)定量時(shí)，檢測者會要求切取較大量的石蠟組織，此時(shí)石蠟切片數(shù)量和切片厚度可能會顯著增加。此時(shí)檢測操作者會采用延長蛋白酶K孵育時(shí)間的方法消化溶解較大量的石蠟組織。一般石蠟組織核酸提取時(shí)蛋白酶K消化孵育的時(shí)間為15分鐘到3小時(shí)，但對于切片較厚且數(shù)量較多的石蠟切片，即使延長蛋白酶K孵育時(shí)間至24小時(shí)也無法將其徹底溶解，容器底部仍然會殘留固體組織。孵育時(shí)間的過度延長會使部分核酸物質(zhì)出現(xiàn)降解，組織殘余的存在不僅會使DNA和RNA提取量減少，而且會使已溶解消化部分組織所提取DNA和RNA對整個(gè)組織的代表性出現(xiàn)偏差，從而影響測定結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種溶解石蠟組織切片的方法，是在完成常規(guī)的第一次蛋白酶K孵育后(一般孵育時(shí)間為60-120分鐘)，將孵育溶解體系升至高溫(80-90攝氏度之間)后維持3-5分鐘后取出，待其冷卻至室溫，再向溶解反應(yīng)體系中加入蛋白酶K，再孵育10-30分鐘即可使組織完全溶解消失，無明顯顆粒物，溶液清亮。

本發(fā)明方法的具體步驟如下：

(1)第一次酶解：在已脫蠟干燥的組織中注入適于蛋白酶酶解的溶液及蛋白酶組成酶解體系，在56攝氏度孵育60-120分鐘；

(2)短時(shí)升溫：完成第一次孵育后將其取出，立即置于高溫下短時(shí)孵育；

(3)第二次酶解：再次向酶解體系中注入蛋白酶，混勻后在56攝氏度孵育10-30分鐘，組織完全溶解；

(4)在第一次或第二次酶解孵育期間，用物理方法震蕩松動正在酶解的組織1-2次。

其中步驟(2)所述短時(shí)升溫中的高溫是指80-90攝氏度。其短時(shí)升溫中的短時(shí)是指3-5分鐘。

其中步驟(4)所述物理方法震蕩松動酶解組織，是指彈擊酶解體系的容器壁或者上下快速震蕩容器。

本發(fā)明的技術(shù)方案是采用短時(shí)升溫二次酶解法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述方法在溶解石蠟組織切片中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供的一種消化溶解石蠟組織切片的方法，專門針對較厚或較大量石蠟組織切片無法在短時(shí)間內(nèi)徹底溶解消化的問題。采用本發(fā)明所述方法可將石蠟組織多量厚切片在3小時(shí)內(nèi)完全消化溶解，使組織溶液澄清，不破壞核酸物質(zhì)，無明顯顆粒物。本發(fā)明方法顯著縮短多量厚切片石蠟組織消化溶解所需時(shí)間，不破壞核酸物質(zhì)，減少長時(shí)間孵育引起的核酸物質(zhì)降解，使所提取核酸物質(zhì)對整個(gè)切片組織具有更完整的代表性。

附圖說明

圖1是短時(shí)升溫二次酶解步驟示意圖。

具體實(shí)施方法

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。

實(shí)施例1