[發(fā)明專利]西瓜抗病基因Cltlp3及其編碼蛋白和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710547100.X
• 申請(qǐng)日: 2017-07-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109207483B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張曼;羊杏平;徐錦華;劉廣;姚協(xié)豐;李蘋(píng)芳;任潤(rùn)生
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C07K14/415;C12N15/11;C12N15/82
• 代理公司: 常州佰業(yè)騰飛專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32231
• 代理人: 高姍

本發(fā)明具體涉及一種西瓜抗病基因Cltlp3及其編碼蛋白和應(yīng)用，本發(fā)明西瓜抗病蛋白ClTLP3，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。該基因的開(kāi)放閱讀框具有SEQ ID NO.1所示的DNA序列。將抗病基因Cltlp3克隆到pET?28a(+)原核表達(dá)載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Rosetta(DE3)中進(jìn)行體外表達(dá)，獲得抗病蛋白。抑菌試驗(yàn)表明抗病蛋白ClTLP3對(duì)尖孢鐮刀菌西瓜專化型、葫蘆尖孢鐮刀菌、茄病鐮刀菌、蔓枯病菌、輪枝鐮刀菌等具有顯著的抑制作用。ClTLP3蛋白能夠作為生防制劑用于西瓜枯萎病、根腐病、蔓枯病的防治，也可作為抗性標(biāo)記用于西瓜及其砧木抗病品種的選育。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種西瓜抗病基因Cltlp3及其編碼蛋白和應(yīng)用。

背景技術(shù)

西瓜是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，我國(guó)是西瓜生產(chǎn)與消費(fèi)的第一大國(guó)。對(duì)西瓜市場(chǎng)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展趨勢(shì)分析表明，隨著市場(chǎng)需求的增加，我國(guó)西瓜種植面積和總產(chǎn)量將繼續(xù)保持穩(wěn)中有升的發(fā)展趨勢(shì)。而西瓜枯萎病是嚴(yán)重制約西瓜生產(chǎn)的主要病害之一，枯萎病是一類土傳維管束系統(tǒng)病害，由尖鐮孢菌西瓜專化型(Fusarium oxysporum f.sp.niveum)侵染引起。根據(jù)西瓜枯萎病菌對(duì)不同鑒別寄主的抗感反應(yīng)，現(xiàn)已鑒定出4種尖鐮孢菌西瓜專化型的生理小種(0、1、2和3)(Zhou等，2010)。其嚴(yán)重危害可造成減產(chǎn)80％以上甚至絕產(chǎn)。

嫁接技術(shù)是生產(chǎn)上有效防治由尖孢鐮刀菌西瓜專化型侵染引起的西瓜枯萎病的重要手段。然而，隨著嫁接西瓜設(shè)施栽培面積的不斷增加，近年來(lái)在我國(guó)不同地區(qū)，葫蘆砧木嫁接西瓜田間發(fā)現(xiàn)嫁接植株發(fā)生了與枯萎病癥狀很相似的病害，根系在土壤中染病，根部及莖基部腐爛，葉片逐漸枯萎直至全株死亡的死秧現(xiàn)象，如2005年浙江省溫嶺市首次出現(xiàn)嫁接西瓜連片枯萎，7.3hm²嫁接西瓜全部死亡。隨后，在河北、湖北等地嫁接西瓜田也發(fā)生了此類病害，致使西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)下降，造成經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)病部位及癥狀主要在根及根莖部，俗稱根腐病。

蔓枯病是一種真菌性病害，可為害多種葫蘆科作物。西瓜蔓枯病在西瓜生長(zhǎng)各個(gè)生育階段均可發(fā)生，特別是中后期，是嚴(yán)重危害西瓜生產(chǎn)的另一真菌病害。在適宜的溫度和濕度條件下，蔓枯病可迅速發(fā)展，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，一般田塊發(fā)病率為15％～25％，嚴(yán)重時(shí)可高達(dá)60％～80％，致減產(chǎn)30％以上。

培育抗病西瓜新品種尤為必要而且迫切。傳統(tǒng)育種是培育西瓜抗病新品種的根本途徑，但西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄，加上優(yōu)質(zhì)抗病種質(zhì)資源極少，限制了西瓜抗病育種的進(jìn)程。2013年，西瓜基因組測(cè)序的完成為西瓜分子生物學(xué)的研究提供了便利(Guo等，2013)。采用分子生物學(xué)手段，研究抗病基因的功能及其在作物與病原菌互作過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制，通過(guò)分子植物育種手段創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因抗病材料，為抗病新品種的培育提供了可能。

病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins，PRs)是寄主與病原物互作過(guò)程中誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類蛋白，不僅在受侵染的組織中積累，在整個(gè)植株中都有表達(dá)(Hamamouch等，2011)。目前已鑒定出17個(gè)不同的PRs蛋白家族，其中有許多具有抗真菌活性(ParvathaReddy，2013)。PR-5蛋白，也稱為類甜蛋白(thaumatin-like proteins，TLP)，是其中非常重要的蛋白之一。研究證明，TLP蛋白不僅能誘導(dǎo)真菌細(xì)胞程序性死亡，抑制真菌侵染；還能誘導(dǎo)植物細(xì)胞的程序性死亡，激活植物防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)途徑，增強(qiáng)植物抗逆境能力。目前已經(jīng)從小麥(栗小英等，2014)、大豆(Hayashi等，2014)、羅勒(Rather等，2015)、荔枝(王樹(shù)軍等，2015)、香蕉(李健平等，2015)、櫻桃番茄(Guo等，2016)等多種植物中克隆到了TLP基因。研究發(fā)現(xiàn)，植物基因組中TLP以基因家族的形式出現(xiàn)，如擬南芥、楊樹(shù)、水稻、玉米基因組中分別有24、49、44、49個(gè)TLPs基因(Cao等，2015)。