[發明專利]一種刪除轉基因大豆篩選標記的方法

在審

• 申請號: 201710546510.2
• 申請日: 2017-07-06
• 公開（公告）號: CN107099551A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發明（設計）人: 李桂蘭;喬瀟;董秋平;喬亞科;張鍇
• 申請（專利權）人: 河北科技師范學院
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,王璐

1.一種刪除轉基因大豆篩選標記的方法，其特征在于，將含有篩選標記的轉基因大豆種子在含有β-雌二醇的育苗基質中播種培養，在大豆種子萌發出苗階段和大豆幼苗生長期間進行β-雌二醇處理誘導，待幼苗生長至21～42d時，篩選獲得能夠表達目的基因、且無篩選標記的轉基因大豆植株，正常管理直到結莢成熟，收獲無篩選標記的轉基因大豆種子。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在大豆種子萌發出苗階段向育苗基質澆灌含有6～14μmol/Lβ-雌二醇的水溶液；在大豆幼苗生長期間向育苗基質澆灌6～14μmol/Lβ-雌二醇霍格蘭氏全營養液。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，根據育苗基質的干濕程度澆灌，以保證大豆苗正常生長所需要的水分和營養。

4.根據權利要求1～3任一項所述的方法，其特征在于，所述標記基因通過含Cre/loxP位點特異性重組系統載體，進入轉基因大豆中，所述標記基因位于兩個loxP位點之間。

5.根據權利要求1～3任一項所述的方法，其特征在于，所述含有β-雌二醇的水溶液和β-雌二醇霍格蘭氏全營養液中β-雌二醇的濃度為8～12μmol/L。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述含有β-雌二醇的水溶液和β-雌二醇霍格蘭氏全營養液中β-雌二醇的濃度為10μmol/L。

7.根據權利要求1～3任一項所述的方法，其特征在于，待幼苗生長至28～42d時，篩選獲得轉基因大豆植株。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，待幼苗生長至35d時，篩選獲得轉基因大豆植株。

9.根據權利要求1～3任一項所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)、將育苗基質混拌均勻，裝入營養缽中，澆入含有6～14μmol/Lβ-雌二醇的水溶液；

(2)、在(1)所述的營養缽中，播種轉基因大豆種子，覆蓋育苗基質1cm，然后覆蓋一層塑料薄膜，按照常規的光照和溫度條件培養，期間根據育苗基質的干濕情況補澆含有6～14μmol/Lβ-雌二醇的水溶液，待其子葉出土并展開后揭開覆蓋的薄膜；

(3)、上述(2)中揭開所覆蓋薄膜以后的幼苗，根據育苗基質的干濕程度澆灌含有6～14μmol/Lβ-雌二醇的霍格蘭氏全營養液，以保證大豆苗正常生長所需要的水分和營養，其余按照常規的光照和溫度條件培養，如此管理直到大豆幼苗生長至21～42d；

(4)、將上述(3)中的大豆幼苗去掉育苗缽，連同育苗基質一起移栽定植到土壤，或者轉移到裝有土壤的大培養容器中；

(5)、將(4)中移栽的大豆植株用PCR方法對目的基因及標記基因擴增，檢測標記基因的刪除情況；

(6)、保留含目的基因而標記基因被剔除了的轉基因植株，正常管理直到結莢成熟，收獲無篩選標記的轉基因大豆種子。