[發明專利]一種批量化對酒類樣品中氨基甲酸乙酯快速測定的方法

有效

• 申請號: 201710546430.7
• 申請日: 2017-07-06
• 公開（公告）號: CN107315038B
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發明（設計）人: 周楠迪;張智威;蔡蓉鳳;田亞平
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N27/26
• 分類號: G01N27/26;G01N27/30;G01N1/34;G01N1/40;C12Q1/00
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所(普通合伙) 32104
• 代理人: 時旭丹;張仕婷

1.一種批量化對酒類樣品中氨基甲酸乙酯快速測定的方法，其特征是步驟如下：首先利用EC專用固相柱對酒類樣品進行前處理萃取出其中的EC；然后在萃取所得溶液體系中加入EC降解酶將EC降解為乙醇、CO₂和NH₄⁺；最后往檢測體系中加入底物丙酮酸鈉和還原性輔酶I NADH并用緩沖液調節pH，利用丙氨酸脫氫酶AlaDH修飾的絲網印刷電極SPE進行電化學檢測，在丙氨酸脫氫酶AlaDH催化下，上步反應生成的NH₄⁺和加入的丙酮酸鈉、還原態的NADH反應生成丙氨酸鈉和氧化態的NAD⁺，利用電流-時間法測定NADH消耗造成的電流響應值下降與EC濃度的線性關系來測算出酒類樣品中EC含量。

2.根據權利要求1所述批量化對酒類樣品中氨基甲酸乙酯快速測定的方法，其特征是具體步驟如下：

（1）制備丙氨酸脫氫酶修飾的絲網印刷電極：將0.1%~0.5%的殼聚糖CS和0.4%~0.7%還原氧化石墨烯RGO加入到100mL 質量濃度為1%的醋酸溶液中得到CS/RGO混合液體系，然后將15~25U/mL丙氨酸脫氫酶加入到該混合體系中，得到CS/RGO/AlaDH生物復合材料；將20~30μL的CS/RGO/AlaDH均勻覆蓋于絲網印刷電極表面，4℃冰箱儲存48h，干燥成膜，制備得到CS/RGO/AlaDH/SPE；

（2）EC標準樣品的檢測和標準曲線的繪制：使用pH 4.5的檸檬酸緩沖液配制不同濃度的標準EC溶液，向其中加入10~16U/mL 的EC降解酶，常溫下反應1h；加入pH10的碳酸鈉緩沖液，將反應體系pH調到10，然后加入30~50mmol/L的丙酮酸鈉和0.4~0.6mmol/L的NADH，隨后將上述修飾好的CS/ RGO/AlaDH/SPE電極插入溶液中，在0.5~0.6V電壓下，利用電流-時間法i-t掃描5min，記錄NADH在反應前后的電流響應變化值；根據電流響應變化值與EC濃度之間的關系，繪制出相應的線性關系標準曲線；

（3）萃取：利用EC專用固相柱對酒類樣品進行前處理，萃取出其中的EC至待檢溶液體系，具體步驟為：準確量取2mL酒類樣品，加入100μL 2.0~3.0μg/mL的D₅-氨基甲酸乙酯內標使用液、氯化鈉0.3~0.4g，40kHz超聲波處理10~20min，混合液加到萃取柱上，抽成0.1MPa真空，靜置10min，先用10~15mL正己烷淋洗除雜，接著用乙酸乙酯：乙醚按照體積比1：1配置成洗脫液進行洗脫，洗脫液收集于具塞刻度試管中，用N₂吹至洗脫液剩余0.4~0.5mL，用pH4.5的檸檬酸緩沖液定容至1.0mL；

（4）計算：取步驟（3）定容后的溶液按步驟（2）操作，測定相應的電流響應變化值，根據上述標準曲線求得EC濃度，并進一步計算出酒樣中的EC含量。

3.根據權利要求2所述批量化對酒類樣品中氨基甲酸乙酯快速測定的方法，其特征是：步驟（3）所述EC專用固相柱為商品化Cleanert EC專用固相柱，堿性硅藻土。

4.根據權利要求2所述批量化對酒類樣品中氨基甲酸乙酯快速測定的方法，其特征是：步驟（3）所述酒類樣品為黃酒。

5.根據權利要求2所述批量化對酒類樣品中氨基甲酸乙酯快速測定的方法，其特征是：步驟（1）所用絲網印刷電極的工作電極直徑為4mm，材料為碳。

6.根據權利要求2所述批量化對酒類樣品中氨基甲酸乙酯快速測定的方法，其特征是：步驟（2）所述不同濃度的標準EC溶液具體為0～1000μM。