[發明專利]一種血液循環腫瘤DNA點突變檢測方法

在審

• 申請號: 201710545914.X
• 申請日: 2017-07-06
• 公開（公告）號: CN107287309A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 羅保君
• 申請（專利權）人: 羅保君
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,白艷

1.一種熒光定量PCR檢測突變型cfDNA或其含有突變位點的部分片段的成套引物，包括擴增突變型靶序列的特異性引物和阻斷序列；

所述突變型靶序列為所述突變型cfDNA含有突變位點的區域；

所述擴增突變型靶序列的特異性引物由突變型上游引物和突變型下游引物組成；

所述突變型上游引物和所述突變型下游引物均與所述突變型靶序列結合，且所述突變型下游引物的3’末端最后一個堿基與所述突變型靶序列中位于所述突變位點的突變堿基互補；

所述阻斷序列與野生型靶序列中含有野生型堿基片段互補，

所述野生型靶序列為所述突變型靶序列核苷酸序列中位于所述突變位點的突變堿基恢復為野生型堿基，使該突變位點變為野生型位點，其余核苷酸不變，得到的序列；

所述阻斷序列的3’端封閉標記；

所述突變型cfDNA為與野生型cfDNA相比存在突變堿基的cfDNA。

2.根據權利要求1所述的成套引物，其特征在于：

所述試劑盒還包括用于擴增野生型靶序列的特異性引物，

所述用于擴增野生型靶序列的特異性引物由野生型上游引物和野生型下游引物組成；

所述野生型上游引物與所述突變型上游引物相同；

所述野生型下游引物為將所述突變型下游引物的3’末端最后一個堿基替換為所述野生型靶序列中位于所述野生型位點的野生型堿基的互補堿基，其余核苷酸不變，得到的引物。

3.根據權利要求1或2所述的成套引物，其特征在于：

所述突變型靶序列和所述野生型靶序列的大小均為60-100bp；

或所述突變位點不位于所述突變型靶序列的兩端或位于所述突變型靶序列的中部；

或所述突變位點位于所述突變型靶序列從5‘端起30-50bp的區域內；

或所述野生型靶序列中含有野生型堿基片段大小為15-25nt；

或所述野生型堿基的互補堿基不位于所述阻斷序列的兩端或位于所述阻斷序列的中部；

或所述野生型堿基的互補堿基位于所述阻斷序列從5‘端起6-15bp的區域內；

或所述各個引物大小均為20-30nt；

或所述阻斷序列的大小為15-25nt。

4.根據權利要求1-3中任一所述的成套引物，其特征在于：

所述突變型上游引物、所述突變型下游引物和所述阻斷序列的摩爾比為1:1：1；

或所述突變型上游引物和所述突變型下游引物的摩爾比為1:1。

5.根據權利要求1-4中任一所述的成套引物，其特征在于：

所述cfDNA或其含有突變位點的部分片段為血液循環腫瘤DNA或其含有突變位點的部分片段；

所述血液循環腫瘤DNA或其含有突變位點的部分片段為K-ras基因或K-ras基因含有突變位點的部分片段；

所述K-ras基因含有突變位點的的核苷酸序列為序列1；

K-ras突變型靶序列的核苷酸序列為序列1；

K-ras突變位點為序列1第49位；

K-ras突變型上游引物的核苷酸序列為序列2；

K-ras突變型下游引物的核苷酸序列為序列3；

K-ras野生型靶序列為序列1的第49位的突變堿基A恢復為野生型堿基G，其余核苷酸不變，得到的序列；

K-ras野生型靶序列中含有野生型堿基片段為所述K-ras野生型靶序列第40－56位核苷酸；

所述阻斷序列的核苷酸序列為序列4；

K-ras野生型上游引物的核苷酸序列均為序列2；

K-ras野生型下游引物為序列5。

6.一種熒光定量PCR檢測突變型cfDNA的PCR試劑，包括A或A+B，

所述A包括權利要求1-5中任一所述成套引物中的所述擴增突變型靶序列的特異性引物、所述阻斷序列和含有DNA聚合酶的PCR緩沖液；

所述B包括權利要求1-5中任一所述成套引物中的所述擴增野生型靶序列的特異性引物和含有DNA聚合酶的PCR緩沖液；

所述擴增突變型靶序列的特異性引物中各條引物在所述A中的濃度均為3pmol/ml；

所述擴增野生型靶序列的特異性引物中各條引物在所述B中的濃度均為3pmol/ml；

所述阻斷序列在所述A中的濃度均為3pmol/ml。