[發(fā)明專利]CYP2C19*3基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標(biāo)、試劑盒及其檢測方法

在審

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• 申請日: 2017-07-05
• 公開（公告）號: CN107312842A
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳丹;賀庭禎;羅德朋;黃東旗;向·霄;熊偉
• 申請（專利權(quán)）人: 重慶京因生物科技有限責(zé)任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 重慶強(qiáng)大凱創(chuàng)專利代理事務(wù)所(普通合伙)50217
• 代理人: 成艷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種CYP2C19*3基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標(biāo)、試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。在人類基因組中SNP廣泛存在，平均每1000個堿基對就會存在1個SNP。這些遺傳變異是造成人類多樣性的基礎(chǔ)，它們中的一些與許多遺傳性疾病的易感性及個體間藥物反應(yīng)的差異有密切聯(lián)系。因此，SNP在分析診斷、臨床檢驗(yàn)、法醫(yī)學(xué)、病原檢測、遺傳疾病和新藥研發(fā)等方面具有重要的應(yīng)用價值；

CYP2C19是細(xì)胞色素450酶(CYP450)家族中的重要成員，參與多種國內(nèi)外權(quán)威指南推薦的一線用藥的代謝(氯吡格雷、質(zhì)子泵抑制劑、西酞普蘭、艾司西酞普蘭、舍曲林、伏立康唑、阿米替林、地西泮等)。該基因的單核苷酸多態(tài)性是造成這些藥物具有顯著個體代謝差異的重要因素，其中CYP2C19*3是該基因最常見的SNP之一。CYP2C19*3(636G>A，rs4986893) 的出現(xiàn)導(dǎo)致CYP2C19編碼的蛋白質(zhì)合成提前終止，使該酶喪失活性。在人群中該SNP位點(diǎn)共存在三種不同的基因型，即突變純合型(*3/*3)、突變雜合型(*1/*3)及野生純合型(*1/*1，不存在CYP2C19*3)。突變純合型患者對藥物的代謝屬于慢代謝型，突變雜合型患者為中等代謝型，而野生純合型患者則屬于正常代謝型；

在亞洲人群中，*3發(fā)生的頻率占5-10％。因此通過患者基因型的確定判定患者的藥物代謝類型，可以幫助醫(yī)生選擇合適的藥物及合理的藥物劑量，在提高藥物使用有效性的同時還可降低毒副作用；

目前，市面上可用于CYP2C19*3檢測的方法有基因芯片法、直接測序法、限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、連接酶檢測反應(yīng)(Ligase Detection Reaction，LDR)、質(zhì)譜檢測法(MassARRAY、MALDI-TOFMS)、改進(jìn)的連接酶檢測反應(yīng)(iMLDR)、SNaPShot檢測法、高分辨率熔解曲線(High Resolution melting，HRM)及Taqman 熒光探針法等。以上方法具有以下一種或多種缺點(diǎn)，如操作繁瑣，耗時，靈敏度低，結(jié)果不穩(wěn)定，易出現(xiàn)假陽性，具有位點(diǎn)選擇性，需要專業(yè)知識、技能、場地及昂貴儀器等缺陷。而現(xiàn)在廣泛采用的Taqman探針法或需要提純的DNA為樣本，或需要抽取血液，或兩者皆需。因此，難以滿足臨床疾病的快速診斷，增加了患者疾病治療的風(fēng)險。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、避免污染且檢測快速的CYP2C19*3基因多態(tài)性快速檢測所涉及的引物、分子信標(biāo)、試劑盒及其檢測方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：CYP2C19*3基因多態(tài)性快速檢測的試劑盒，

包括PCR反應(yīng)液、特異性引物和分子信標(biāo)；PCR反應(yīng)液的原料及終濃度為，

DNA聚合酶0.05-0.12U/μL；dNTPs 0.2mM；5X反應(yīng)緩沖液1X；MgCl2 1.5-3.5mM；十二烷基硫酸鈉0.0005-0.015％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0.03％ (w/v)；

特異性引物包括正向引物和反向引物，且其終濃度均為0.2-0.5μM；

分子信標(biāo)包括突變型探針和野生型探針，且其終濃度均為0.4-0.6μM；

其用于檢測細(xì)胞樣品。