[發明專利]一種氨基轉移酶、突變體及其制備西他列汀的應用

有效

• 申請號: 201710543569.6
• 申請日: 2017-07-05
• 公開（公告）號: CN107384887B
• 公開（公告）日: 2020-08-21
• 發明（設計）人: 何人寶;鄭裕國;程峰;柳志強;金逸中;湯曉玲;邵鴻鳴;張曉健;周國斌;林嬌華;張峰;楊海龍
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;浙江永太科技股份有限公司;浙江永太藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12P17/18
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種氨基轉移酶，其特征在于所述氨基轉移酶氨基酸序列為SEQ ID NO：2所示。

2.一種權利要求1所述氨基轉移酶在生物催化合成西他列汀中的應用。

3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的應用以含有氨基轉移酶編碼基因的重組大腸桿菌經發酵培養獲得的濕菌體為生物催化劑，以西他列汀前體酮為底物，以二甲基亞砜為助溶劑，以磷酸吡哆醛為輔酶，以異丙胺為輔底物，以pH 8-9三乙醇胺緩沖液為反應介質構成反應體系，在溫度30-45℃、攪拌速度100-250r/min的條件下進行生物催化反應，反應結束后，將反應液分離純化，獲得西他列汀；所述反應體系中，濕菌體用量為10～100g/L，底物終濃度為2～50g/L，二甲基亞砜體積終濃度為10-40％，磷酸吡哆醛終濃度0.5g/L，異丙胺終濃度10g/L。

4.一種權利要求1所述氨基轉移酶突變體，其特征在于所述突變體的氨基酸序列為SEQID NO：4或SEQ ID NO：6所示。

5.一種權利要求4所述氨基轉移酶突變體在生物催化合成西他列汀中的應用。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述的應用為：以含有氨基轉移酶突變體編碼基因的重組大腸桿菌經發酵培養獲得的濕菌體為生物催化劑，以西他列汀前體酮為底物，以二甲基亞砜為助溶劑，以磷酸吡哆醛為輔酶，以異丙胺為輔底物，以pH 8-9三乙醇胺緩沖液為反應介質構成反應體系，在溫度30-45℃、攪拌速度100-250r/min的條件下進行生物催化反應，反應結束后，將反應液分離純化，獲得西他列汀；所述反應體系中，濕菌體用量為10-100g/L，底物終濃度為2～50g/L，二甲基亞砜體積終濃度為10-40％，磷酸吡哆醛終濃度0.5g/L，異丙胺終濃度10g/L。

7.如權利要求5所述的應用，其特征在于當突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO：6所示時，所述的應用為：以含有氨基轉移酶突變體編碼基因的重組大腸桿菌經發酵培養獲得的濕菌體為生物催化劑，以潛手性羰基化合物為底物，以二甲基亞砜為助溶劑、以磷酸吡哆醛為輔酶、以異丙胺為輔底物，以pH 8-9三乙醇胺緩沖液為反應介質構成反應體系，在溫度25-35℃、攪拌速度100-250r/min的條件下進行生物催化反應，反應結束后，將反應液提純，獲得西他列汀中間體，對西他列汀中間體進行Boc保護，然后用Boc的轉氨產物合成西他列汀；所述反應體系中，濕菌體用量為10～100g/L，底物終濃度為2～60g/L，二甲基亞砜體積終濃度為10-40％，磷酸吡哆醛終濃度0.5g/L，異丙胺終濃度10g/L；所述底物為下列之一：3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸甲酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸異丙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸乙酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸異丁酯、3-羰基-4-(2,4,5-三氟苯基)-丁酸卞酯或3-羰基-1-[3-(三氟甲基)-5,6,7,8-四氫-1,2,4-三唑并[4,3-a]吡嗪-7-基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮。

8.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述分離純化方法為：反應結束后，用濃鹽酸將反應液pH調至1.5，加入硅藻土吸附細胞，攪拌20min，過濾，獲得濾液a和濾渣a，向濾渣a中加入1M鹽酸，攪拌20min，抽濾，獲得濾液b和濾渣b；合并濾液a和濾液b，用二氯甲烷萃取一次，獲得有機相a和水相a，有機相a用1M鹽酸萃取，獲得有機相b和水相b，合并水相a和水相b并用氫氧化鈉調節pH至12，再用二氯甲烷萃取，獲得有機相c和水相c，水相c中再加入二氯甲烷萃取，獲得有機相d和水相d，合并有機相c和有機相d并用飽和氯化鈉水洗二次，加入無水硫酸鈉干燥，抽濾去除硫酸鈉，45℃下旋轉蒸發，得到西他列汀；所述硅藻土用量以反應液體積計為0.18g/mL。

9.如權利要求6所述的應用，其特征在于所述濕菌體按如下方法制備：將含有氨基轉移酶突變體編碼基因的重組大腸桿菌接種至含有50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基，37℃，200rpm下培養12h，再以體積濃度1％接種量接種至新鮮的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液體培養基中，于37℃，150rpm下培養至菌體OD₆₀₀達0.6-0.8，加入終濃度為0.1mM的IPTG，28℃下誘導培養12h后，4℃、5000rpm離心20min，棄去上清液，收集沉淀，即獲得所述的濕菌體。