[發明專利]一種M1病毒全長感染性克隆及制備方法及其在制備M1病毒中的應用

在審

• 申請號: 201710541587.0
• 申請日: 2017-07-05
• 公開（公告）號: CN109207491A
• 公開（公告）日: 2019-01-15
• 發明（設計）人: 賈凡;徐富強
• 申請（專利權）人: 中國科學院武漢物理與數學研究所
• 主分類號: C12N15/40
• 分類號: C12N15/40;C12N15/63;C12N15/66;C12N7/00
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明公開了一種M1病毒全長感染性克隆及制備方法及其在制備M1病毒中的應用。所述的M1病毒全長感染性克隆，其序列為SEQ ID NO.6所示。該全長感染性克隆成功制備出M1病毒。本發明成功獲得可用于制備各種重組M1病毒的M1病毒的反向遺傳學系統?全長感染性克隆，其在神經環路標記、腫瘤感染與消滅、藥物篩選平臺的建立、藥物抑制病毒作用機制的分析、疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立、病毒復制和致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，更具體涉及一種M1病毒全長感染性克隆及制備方法及其在制備M1病毒中的應用。

背景技術

M1病毒屬于披膜病毒科甲病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，長度約為12kb。基因組編碼的多聚蛋白可被切割成5個結構蛋白(C,E3,E2,6K和E1)和4個非結構蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)。盡管該病毒發現已經有較為長遠的歷史，但是其與細胞的互作機制、病毒的復制機制等尚不清楚。病毒的反向遺傳學系統包括：全長感染性克隆、復制子和病毒樣顆粒等。這些系統對于充分了解病毒與宿主的互作機制、病毒的復制機制，以及改造病毒具有十分重要的意義。然而目前為止，尚無M1病毒的反向遺傳學系統，從而限制了相關的研究。

隨著分子生物學的不斷發展，科學家已經能夠通過一系列方法建立病毒的反向遺傳學系統，并進一步來定向改造病毒，為深入開展相關的病毒學研究提供了良好的工具。因此，本發明分別采用不同的技術途徑獲得了M1病毒全長感染性克隆。將在神經環路標記、感染與消滅腫瘤細胞、藥物篩選平臺的建立、藥物抑制病毒作用機制的分析、病毒疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立和病毒復制與致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值和前景。

發明內容

本發明的目的在于提供了一種M1病毒的全長感染性克隆，其序列為SEQ ID NO：6所示。

本發明的目的在于提供了一種M1病毒全長感染性克隆的制備方法，方法簡單，易行。

本發明的目的在于提供了一種M1病毒全長感染性克隆應用，該全長感染性克隆可用于制備M1病毒，制備的M1病毒可應用于腦科學研究、感染腫瘤細胞并殺滅、藥物篩選和抗原表位分析，也在藥物抑制病毒作用機制的分析、疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立和病毒復制與致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值。

為了實現以上目的，本發明采用如下技術方案：

M1病毒全長感染性克隆的構建：

分別采用酶切和同源重組的方法將M1病毒基因組四個片段F1(SEQ ID NO:1)、F2(SEQ ID NO:2)、F3(SEQ ID NO:3)和F4(SEQ ID NO:4)順次插入載體F5(SEQ ID NO:5)的PacI和RsrII酶切位點之間，獲得的測序正確的克隆命名為M1-F1-F2-F3-F4,即為M1病毒的全長感染性克隆pFLM1，其序列為SEQ ID NO.6所示。

M1病毒的制備：

1.將全長感染性克隆pFLM1轉染BHK21細胞培養，在不同時間收集病毒上清；

2.用MluI酶切pFLM1，回收被酶切的產物，使用MEGAscript T7Transcription Kit體外轉錄酶切后的pFLM1成為RNA，并轉染BHK21細胞，37℃，5％(v/v)CO₂培養箱中培養，并同時設置未轉染RNA的細胞作為對照組，通過顯微鏡觀察實驗組和對照組的細胞狀態。

以上方法制得的M1病毒可應用于腦科學研究、感染腫瘤細胞并殺滅、藥物篩選和抗原表位分析，也在藥物抑制病毒作用機制的分析、疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立和病毒復制與致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值。

本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：