[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于糞便和土壤代謝組學(xué)研究的樣品制備處理方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710541464.7
• 申請(qǐng)日: 2017-07-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107121517B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-11-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張潔;王曉飛;郭睿
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 賽思萊(廈門(mén))科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/06
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 35218 廈門(mén)市精誠(chéng)新創(chuàng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 方惠春<國(guó)際申請(qǐng)>=<國(guó)際公布>=<進(jìn)入

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于糞便和土壤代謝組學(xué)研究的樣品制備處理方法。先對(duì)樣品預(yù)處理得第一懸混液，再加入鋼珠震蕩破碎提取得到破碎后的第一懸混液，超聲，離心，收集第一上清液和沉淀；第一上清液濃縮至近干，加入水溶性復(fù)溶液，鋼珠，震蕩復(fù)溶；高速離心，所得第二上清液為水溶性代謝提取物，可直接上機(jī)分析；收集的沉淀加入脂溶性代謝物提取液混勻，得第二懸混液；震蕩破碎提取，超聲，離心，收集下層溶液，氮吹的方法使所得下層溶液吹干，加入脂溶性復(fù)溶液，鋼珠，震蕩復(fù)溶；高速離心，所得為脂溶性代謝提取物，可直接上機(jī)分析。本發(fā)明所述方法操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性強(qiáng)、全面的、回收率高，對(duì)大量開(kāi)展糞便和土壤代謝組學(xué)的相關(guān)研究具有重大的意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及糞便和土壤樣品處理中以代謝組學(xué)分析為目的的全代謝物提取和處理方法。尤其涉及一種用于糞便和土壤代謝組學(xué)研究的樣品制備處理方法。

背景技術(shù)

代謝組學(xué)作為繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后興起的新技術(shù)，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成。代謝組學(xué)對(duì)某一時(shí)刻生物體內(nèi)所有生命活動(dòng)所涉及代謝物的質(zhì)和量的變化情況進(jìn)行綜合分析，從而揭示生物體所處的生理狀態(tài)。代謝組學(xué)具有高通量檢測(cè)和強(qiáng)大的數(shù)據(jù)模型分析能力，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于眾多研究領(lǐng)域，比如疾病診斷與機(jī)理、藥物研發(fā)、污染物毒理、營(yíng)養(yǎng)食品科學(xué)、植物學(xué)及生態(tài)學(xué)等。利用代謝組學(xué)可以高通量地篩選暴露-效應(yīng)標(biāo)志物，標(biāo)志物本身就是毒性機(jī)制中的關(guān)鍵分子，與其它分子指標(biāo)結(jié)合通過(guò)聚類(lèi)和關(guān)聯(lián)分析可發(fā)現(xiàn)重要毒性通路。

糞便是生物體最終的代謝產(chǎn)物集合體，富含大量的內(nèi)源性代謝物以及微生物代謝物的信息，對(duì)于我們認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)的生物學(xué)過(guò)程具有重要意義。

生態(tài)代謝組近年來(lái)引起了科學(xué)界的廣泛關(guān)注，旨在研究生化因子影響與生態(tài)學(xué)現(xiàn)象之間的關(guān)系、生物群落中不同種群間的協(xié)同進(jìn)化等等，在環(huán)境監(jiān)測(cè)、生態(tài)系統(tǒng)預(yù)警等應(yīng)用生態(tài)學(xué)及物種進(jìn)化、生態(tài)型鑒別等理論生態(tài)學(xué)研究中顯示出巨大潛力。生態(tài)代謝組研究涉及土壤樣品，通過(guò)定性和定量測(cè)定某種擾動(dòng)情況(如溫度、濕度、環(huán)境污染等等)下土壤代謝組的變化，從而在代謝物層面表征對(duì)生態(tài)環(huán)境的影響。

糞便和土壤這類(lèi)固體樣品成分非常復(fù)雜，代謝物質(zhì)種類(lèi)繁多，物理性質(zhì)差異較大，且基質(zhì)干擾非常嚴(yán)重。目前常規(guī)的代謝組提取和處理方法過(guò)程繁瑣，提取和處理過(guò)程容易造成污染和不確定因素，且通常伴隨著代謝物質(zhì)組的變性，活性喪失和代謝物回收率低下。而且由于往往采用單一的提取液，造成代謝組提取不完整的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性強(qiáng)、全面的、回收率高的糞便和土壤代謝組學(xué)研究樣品的制備處理方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種用于糞便和土壤代謝組學(xué)研究的樣品制備處理方法，其特征在于，其經(jīng)過(guò)下列工藝步驟，

(1)樣品預(yù)處理：取適量在-80℃冰箱內(nèi)過(guò)夜預(yù)冷的糞便或土壤樣品，放入冷凍干燥機(jī)，干燥至衡重，低溫破碎，按照100mg樣品/1mL水溶性代謝物提取液的比例加入水溶性代謝物提取液，使其混勻，得到第一懸混液；(低溫可使酶失活并防止代謝物發(fā)生降解)

(2)震蕩破碎提取：按照100-200mg糞便或土壤樣品/2顆鋼珠的比例加入鋼珠到所述第一懸混液，低溫下震蕩破碎得到破碎后的第一懸混液；

(3)超聲提取：將所述破碎后的第一懸混液在冰上進(jìn)行超聲，進(jìn)一步破碎樣品使代謝物質(zhì)溶出；離心，收集第一上清液和沉淀；

(4)將上述所得第一上清液放入旋轉(zhuǎn)濃縮儀中，濃縮至近干后，再按照100-200mg糞便或土壤樣品/200μL水溶性復(fù)溶液的比例加入水溶性復(fù)溶液，再按照100-200mg糞便或土壤樣品/1顆鋼珠的比例加入鋼珠，震蕩復(fù)溶；高速離心，所得第二上清液為水溶性代謝提取物，可直接上機(jī)分析；

(5)按照100mg糞便或土壤樣品/1mL脂溶性代謝物提取液的比例加入向上述所得沉淀中加入脂溶性代謝物提取液，使其混勻，得第二懸混液；