[發明專利]抗EGFR?L858R蛋白單克隆抗體及其用途

在審

• 申請號: 201710540766.2
• 申請日: 2017-07-05
• 公開（公告）號: CN107236042A
• 公開（公告）日: 2017-10-10
• 發明（設計）人: 何為無;陳才偉;馬東暉;魏海濤;王廣力;褚伯陽;戚莉莉;葉露;閆文廣
• 申請（專利權）人: 無錫傲銳東源生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C12N5/20;G01N33/68;G01N33/577;G01N33/569
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技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及可特異結合EGFR-L858R蛋白的單克隆抗體UMAB233、產生所述單克隆抗體的細胞株及應用該抗體用于診斷的方法和用途。

背景技術

肺癌，是中國最常見的癌癥，往往診斷時已是晚期。非小細胞肺癌(NSCLC)占了肺癌的80％～85％。晚期NSCLC患者一定程度上受益于細胞毒化療；最新的靶向療法的應用為我們提供了這種疾病治療的新的選擇。

NSCLC經常有表皮生長因子(EGFR)突變。EGFR酪氨酸激酶中，發現有突變的四個外顯子18～2l，其中19號外顯子缺失(745-750Del)和21號外顯子點突變(L858R)突變是兩大經典的突變，分別占EGFR突變的53％和26％，剩下的21％非典型突變包括20號外顯子的T790M，18號外顯子的G719A，21號外顯子的L861Q等。EGFR-L858R是指EGFR的第858位亮氨酸(L)點突變為精氨酸(R)。

小分子EGFR酪氨酸激酶抑制劑(TKIs)，包括厄洛替尼及吉非替尼，是最早在中國用于晚期NSCLC患者的藥物。最近的數據表明，EGFR突變與NSCLC標準一線化療相比，改善了無進展生存(PFS)并提高了療效。因此，EGFR突變狀態的檢測對患者治療方案的選擇具有十分重要的意義。

目前在臨床上通常用RT-PCR、免疫組織化學(Immunohistochemistry,IHC)病理實驗等方法檢測腫瘤組織中EGFR-L858R的表達狀況，其中IHC由于更加簡便和經濟而廣泛應用于臨床病理診斷之中，該實驗方法的核心為特異性結合EGFR-L858R的單克隆抗體，其性能的優劣直接決定著整個檢測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結合特異性較高的針對EGFR-L858R蛋白的單克隆抗體具有重要的意義。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種結合特異性較高的EGFR-L858R蛋白的單克隆抗體，及其在制備用于檢測EGFR-L858R蛋白的免疫檢測工具中的應用。

本發明提供了一種雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱為CGMCC)，保藏日期為2017年4月6日，保藏編號為CGMCC No.13825。

本發明還提供了一種特異性結合EGFR-L858R蛋白的單克隆抗體UMAB233，由上述雜交瘤細胞株產生。

本發明所述單克隆抗體的制備方法如下：

(1)單克隆抗體的篩選與制備：采用合成的EGFR-L858R突變多肽(購買杭州中肽生化有限公司)免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟細胞與SP2/0細胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽性雜交瘤細胞，獲得能分泌抗EGFR-L858R特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為UMAB233，亞型鑒定為IgG1；通過無血清培養基制備抗體，通過親和層析柱純化獲得EGFR-L858R單克隆抗體。分別通過Western Blot、免疫組化實驗驗證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。

進一步采用OriGene高密度蛋白芯片對上述單克隆抗體的特異性進行驗證：

OriGene高密度蛋白芯片上包含10,000個HEK293T細胞蛋白過表達裂解物(不包含EGFR-L858R蛋白裂解液)，每種蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘蛋白裂解液的定位可以通過Excel文件進行準確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣，每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監控每次免疫反應數據的重復性，以及定位陽性信號的方向。

本發明將所述單克隆抗體UMAB233與上述芯片雜交并確定陽性信號位點，結果顯示：本發明所述單克隆抗體UMAB233與芯片上所有蛋白無交叉反應。

本發明還提供了單克隆抗體UMAB233在制備用于檢測EGFR-L858R蛋白的免疫檢測工具中的應用。

具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。

在具體的實施例中，本發明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗體UMAB233，可檢測腫瘤細胞中EGFR-L858R的表達狀況。

本發明還提供了上述單克隆抗體在制備用于檢測腫瘤細胞中EGFR-L858R蛋白水平的試劑盒中的應用。

其中所述腫瘤具體包括但不限于肺癌等。