[發明專利]三七幾丁質酶基因PnCHI1的應用

有效

• 申請號: 201710540050.2
• 申請日: 2017-07-05
• 公開（公告）號: CN107365794B
• 公開（公告）日: 2020-07-10
• 發明（設計）人: 劉迪秋;唐筆鋒;普麗梅;崔秀明;曲媛
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82;C12N15/56
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本發明公開了三七幾丁質酶基因PnCHI1提高煙草對葡萄座腔菌、膠孢炭疽菌抗性中的應用，PnCHI1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，編碼幾丁質酶；本發明通過功能基因組學相關技術研究證實PnCHI1基因具有提高植物對病原真菌抗性的功能，將本發明抗真菌基因PnCHI1構建到植物表達載體上并轉入煙草中過量表達，轉基因煙草植株具有很強的體外抗真菌活性；PnCHI1超表達的轉基因煙草對葡萄座腔菌和膠孢炭疽菌的生長均具有很強的抑制作用。

技術領域

本發明涉及分子生物學以及基因工程領域相關技術，特別是一種三七幾丁質酶基因PnCHI11的應用。

背景技術

植物在生長發育過程中會受到許多生物和非生物因子的脅迫，如干旱、寒冷、UV射線、創傷、病原物（真菌、細菌、病毒）侵染等，為此生物進化出一系列防御機制來抵御逆境脅迫，病程相關蛋白（pathogenesis-related protein, PR）的激活和積累是植物防御反應的重要組成部分（Singh A，Kirubakaran S I，Sakthivel N. Heterologous expression ofnew antifungal chitinase from wheat. Protein Expr Purif，2007，56(1):100.）。植物表達多種病程相關蛋白基因以應對病原菌等多種逆境因子的危害，其中PR3基因家族編碼的幾丁質酶(chitinase)在植物抗病防衛反應中備受關注。

幾丁質，又稱甲殼素或甲殼質，是由N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)通過β-1,4糖苷鍵連接而成的線性多糖，是地球上僅次于纖維素的第二豐富的生物聚合物。它存在3種形式，分別為α-幾丁質、β-幾丁質和γ-幾丁質，這些不同形式的幾丁質在組裝和相鄰鏈的極化方面有所不同（Bussink A P, Speijer D, Aerts J M F G, et al. Evolution of mammalianchitinase (-like) members of family 18 glycosylhydrolases. Genetics, 2007,177(2): 959-970.）。α-幾丁質是其主要的存在形式，由N-乙酰葡萄糖胺以反向平行的方式線性排列而成，β-幾丁質是由兩條同向平行鏈排列形成的，而γ-幾丁質則是由3條鏈組成，兩條同向，一條反向（王士奎, 王漢潛. 幾丁質及脫乙酰幾丁質的微生物降解作用.微生物學通報, 1994, 21(3): 180-183.）。幾丁質酶是一類可水解幾丁質的大小分布于20-90kD的糖基水解酶（Bhattacharya D, Nagpure A, Gupta R K. Bacterial chitinases:properties and potential. Critical Reviews in Biotechnology, 2007, 27(1): 21-28.）。其中微生物幾丁質酶多為20～60kD，植物幾丁質酶在20～45kD內，昆蟲幾丁質酶為40～85ku。植物幾丁質酶存在于植物的莖、種子、花中，它們的表達存在組織特異性。大多植物幾丁質酶相對分子質量都比昆蟲幾丁質酶相對分子質量小，其中最小的幾丁質酶大小為22 kD。根據作用于幾丁質酶的方式不同，可以將幾丁質酶分為內切幾丁質酶和外切幾丁質酶兩大類，根據初級序列和催化機制可以把幾丁質酶分為糖苷水解酶18家族和糖苷水解酶19家族，根據氨基酸序列的相似性和幾丁質結合結構域的有無可把幾丁質酶分為7大類：Class I~ Class VII。典型的幾丁質酶具有一個N端信號肽（signal peptide）、一個催化結構域（catalytic domain）和只存在于液泡幾丁質酶中的C端結構域（C-terminalextension）。有些幾丁質酶N端信號肽含有一個或者多個富含半胱甘酸的幾丁質結合域（chitin-blinding domains, CBD），此外，在CBD和催化域之間有一個可變的交聯區（flexible hinge region）（楊海霞，鄧建軍，張建，等. 植物幾丁質酶純化、測定及應用研究進展. 食品工業科技，2011，32(6):431.）。