[發明專利]一種千層塔葉片原生質體的制備方法有效
| 申請號： | 201710538688.2 | 申請日： | 2017-07-04 |
| 公開（公告）號： | CN107267436B | 公開（公告）日： | 2021-07-13 |
| 發明（設計）人： | 郭斌;姚凱;宋敏;李夢青;任靜宇;尉亞輝 | 申請（專利權）人： | 西北大學 |
| 主分類號： | C12N5/04 | 分類號： | C12N5/04 |
| 代理公司： | 西安恒泰知識產權代理事務所 61216 | 代理人： | 孫雅靜 |
| 地址： | 710069 *** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 千層塔 葉片 原生 質體 制備 方法 | ||
1.一種千層塔葉片原生質體的制備方法，其特征在于，包括：將千層塔葉片在無菌操作臺上切割成1mm2的小片，再經含有抗壞血酸和甘露醇的MS固體培養基進行預培養，預培養后的千層塔葉片再經預酶解及低壓再酶解即得千層塔原生質體；
所述MS固體培養基中抗壞血酸的含量是350～500mg/L；
所述MS固體培養基中甘露醇的含量是0.5～1.0 mol/L；
所述的低壓再酶解是將葉片在壓力為30～60 KP的酶解液中進行酶解，酶解液的加入量為每克葉片添加10 mL酶解液，酶解的時間是1-3小時；
所述酶解液的成分為：質量百分濃度1.5%Onozuka R-10、質量百分濃度2.5%Macerozyme Ｒ-10、0.4%葡聚糖硫酸鉀、5.0 mmol/L CaCl2、0.65 mol/L甘露醇，pH=5.8，用微孔濾膜過濾除菌；
所述的預酶解是將葉片在酶解液中酶解，酶解時間為2小時，酶解液的加入量為每克葉片添加10 mL酶解液。
2.如權利要求1所述的千層塔葉片原生質體的制備方法，其特征在于，所述的預培養的時間為2天，預培養的溫度為2℃，預培養的條件為黑暗條件。
3.如權利要求1所述的千層塔葉片原生質體的制備方法，其特征在于，在千層塔葉片進行預培養之前，還需對千層塔葉片進行預處理，預處理包括：
將千層塔葉片依次經水、體積分數為75%的乙醇、體積分數為5% 的NaOCl 溶液及體積分數為7%的過氧化氫溶液浸泡后即可。
4.如權利要求3所述的千層塔葉片原生質體的制備方法，其特征在于，所述的千層塔葉片在體積分數為75%的乙醇溶液中浸泡1min，千層塔葉片在體積分數為5% 的NaOCl 溶液浸泡15min，千層塔葉片在體積分數為7%的過氧化氫溶液浸泡10min。
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