[發明專利]一種利用瓊脂糖凝膠親和層析色譜提取醫藥級超高純度乳酸鏈球菌素的方法

有效

• 申請號: 201710537590.5
• 申請日: 2017-07-04
• 公開（公告）號: CN107056903B
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 梁恒宇;張欽革;陳傲冰;王貴元;郭坤;張良
• 申請（專利權）人: 安泰生物工程股份有限公司
• 主分類號: C07K14/315
• 分類號: C07K14/315;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/22
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 侯靜

1.一種利用瓊脂糖凝膠親和層析色譜提取醫藥級超高純度乳酸鏈球菌素的方法，其特征在于它是按照以下步驟進行：

以生物效價≥15000 IU/mg的乳酸鏈球菌素粗制半成品為原料，再經過瓊脂糖凝膠親和色譜層析柱進行乳酸鏈球菌素純化，最后經過冷凍干燥制成超高純度乳酸鏈球菌素純品；

其中，生物效價≥15000 IU/mg的乳酸鏈球菌素粗制半成品的制備方法如下：

一、利用陶瓷膜對乳酸鏈球菌素最終發酵活力≥8500 IU/mL的發酵液進行固液分離，分離得到清液進行下一步處理；其中，分離前發酵液的pH預先調至2.5，并在70℃下恒速攪拌30min；

二、利用孔徑不同的兩級膜對上步驟得到的清液進行第一級和第二級的分離和濃縮，第一級分離后濃縮倍數為4~8倍，第二級分離后濃縮倍數為8~14倍，得到的濃縮液進行下一步處理；所述的兩級膜為卷式超濾膜，其中，第一級膜孔徑為10000~100000；第二級膜孔徑為1000~10000；

三、利用竹制或椰殼制顆粒狀活性炭對上述濃縮液進行脫色處理，得到脫色后濃縮液；

四、利用泡沫分離法對步驟三得到的脫色后濃縮液進行乳酸鏈球菌素的二次濃縮分離，在泡沫分離過程中以2~6個碳原子數的食品級分析純正烷醇對泡沫進行消泡處理，得到的消泡濃縮液加入0.5~1.5倍體積的相同的正烷醇，在轉速為10~50 轉/min的條件下攪拌30~60min，靜置12~24h，待沉淀完全后進行下一步離心處理；

五、利用三項轉鼓離心分離機對上步得到的消泡濃縮液進行離心濃縮，離心轉速為8000~12000 r/min，離心時間為5~10min，離心后收集固相物即為乳酸鏈球菌素粗制半成品原料，其生物效價≥15000 IU/mg，水分含量為10%~30%；

所述的經過瓊脂糖凝膠親和色譜層析柱進行乳酸鏈球菌素純化的操作步驟為：

一、用pH為2.50~3.50的平衡緩沖液，以0.001~0.100 L/min的流速對瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行柱平衡，當流出液的pH與平衡緩沖液的pH相同時停止柱平衡；

二、取生物效價≧15000 IU/mg的乳酸鏈球菌素粗制半成品，溶解于平衡緩沖液中，配制成濃度為1.0~50.0 g/L的樣品走柱液，在經過步驟一柱平衡后的瓊脂糖凝膠色譜柱上對樣品走柱液進行走柱處理以吸附乳酸鏈球菌素分子，當流出液中的乳酸鏈球菌素的生物效價≧50 IU/mL，則瓊脂糖凝膠層析色譜吸附達到飽和；

三、乳酸鏈球菌素走樣吸附達到飽和后，再用平衡緩沖液頂柱，清除柱層空隙中沒有完全被吸附的樣品走柱液，當流出液的pH與平衡緩沖液的pH相同時，停止頂柱處理；

四、用pH在2.00~3.00之間的洗脫液對步驟三處理后的瓊脂糖凝膠親和層析色譜柱進行分離產物洗脫，以0.001~0.100 L/min的流速對色譜柱進行柱洗脫，在洗脫過程中分三段對洗脫液進行收集：第一段為光吸收130以下收集，第二段為光吸收130到峰值再降到80之間收集，第三段為光吸收80到20之間收集，當流出液的pH與洗脫液相同時停止洗脫；

其中，平衡緩沖液是酸與鈉鹽的混合溶液，平衡緩沖液中的酸的濃度為0.04~0.14mol/L，鈉鹽的濃度為0.04~0.14mol/L；

其中，洗脫液是酸與鈉鹽和氯鹽的混合溶液，洗脫液中酸的濃度為0.02~0.12mol/L，鈉鹽的濃度為0.02~0.12mol/L，氯鹽的濃度為0.1mol/L ；在經過冷凍干燥制成超高純度乳酸鏈球菌素純品之前，需將經過瓊脂糖凝膠親和色譜層析柱純化后的乳酸鏈球菌素，進行酸沉淀后離心、洗滌處理；

在進行酸沉淀后離心、洗滌處理后的乳酸鏈球菌素進行冷凍干燥制成超高純度乳酸鏈球菌素純品，具體操作如下：

一、將收集到的洗脫液，按照其體積的12%~20%添加配制好的強酸溶液，在轉速為10~50 轉/min的條件下攪拌30~120min，靜止沉淀12~24h；

二、將上述沉淀后的液體在0~4℃溫度下離心10min，轉速為6000~12000 rpm，離心后棄去上清液；

三、將上述離心得到的沉淀加入含有質量體積百分含量為12%~20%三氯乙酸的丙酮，將沉淀完全打散，在0~4℃溫度下離心10~30 min，轉速為6000~12000 rpm，離心后棄去上清液，收集沉淀；

四、用1~2倍體積的丙酮清洗步驟三的沉淀2~3次；

五、將處理清洗后的沉淀放入冷凍干燥機中，在-40℃~-20℃條件下進行冷凍干燥，凍干10~20h；

六、將凍干后的沉淀用膠體磨研磨成粉，然后進行生物效價的檢測，放置在低溫冰箱中保存，即制得超高純度乳酸鏈球菌素純品；其中，所述的強酸溶液濃度為30%~60%；所述的強酸為三氟乙酸。