[發明專利]一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法

有效

• 申請號: 201710537281.8
• 申請日: 2017-07-04
• 公開（公告）號: CN107254449B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 范金秀;周明光;徐高原;陳波;陳關平
• 申請（專利權）人: 武漢科前生物股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇;徐曉琴

本發明屬于疫苗技術領域，具體涉及一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法。所述方法采用了連續流離心、中空纖維澄清過濾、超濾濃縮、分子篩純化工藝，最大限度的增加了病毒的回收率，降低了雜蛋白的含量。本發明制備的豬偽狂犬病毒濃縮液、純化抗原尤其適用于制備疫苗，相較于現有技術生產的豬偽狂犬病滅活疫苗而言，安全性更高，均一性更好，免疫效果更好，從根本上減少了疫苗的副反應。

技術領域

本發明屬于疫苗技術領域，具體涉及一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法。

背景技術

偽狂犬病(Porcine Pseudorabies)是由偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的發生在多種家畜和野生動物體內的一種急性傳染病，以發熱、奇癢、腦脊髓炎為主要發病癥狀。豬是偽狂犬病的唯一自然宿主，對其危害大。可致妊娠母豬流產，產死胎及胎兒干尸化。對初生仔豬則引起神經癥狀，出現運動失調，麻痹，衰竭死亡，病死率100％。成年豬多呈隱性感染。病豬、帶毒豬及帶毒鼠類是本病的主要傳染源。豬既是本病的原發感染宿主，又是病毒的長期貯存者和排毒者，在偽狂犬病的傳播上起著重要作用。偽狂犬病的傳播和蔓延，給養殖業造成了巨大損失。

本病目前無特效治療藥物，對感染發病豬可注射豬偽狂犬病高免血清，對未發病受威脅豬進行緊急免疫接種。本病以預防為主，疫苗的免疫接種是預防和控制豬偽狂犬病的根本措施，目前國內外已研制出豬偽狂犬病的常規弱毒疫苗、滅活疫苗和基因缺失疫苗，這些疫苗都能在一定程度上減輕或防治偽狂犬病的臨床癥狀，從而減少造成的經濟損失。

目前，我國商品化的豬偽狂犬病病毒疫苗主要是基因缺失活疫苗，其安全性和有效性主要受病毒滴度，抗原純凈性，滅活工藝及佐劑等因素的影響。常規工藝生產的豬偽狂犬病毒滅活疫苗在臨床應用中有一定的副反應，主要與病毒抗原中所含的抗原外成分有關。這些成分包括：病毒培養用動物細胞的殘留蛋白質和殘留DNA；培養基殘留如小牛血清；滅活劑殘留等。這些異源成分不僅會引起免疫動物的副反應，而且會大大降低疫苗的效力。以傳統滅活全病毒作為抗原的純化工藝主要以自然沉降、離心、膜包濃縮等工藝為主，生產的疫苗中有效抗原含量增加，同時有害物質殘留量濃度也升高，導致疫苗產品存在安全性隱患。所以，提高病毒滴度和抗原純凈性是提升疫苗質量的基本途徑。

中空纖維膜過濾技術是料液以一定的流速在膜的上表面循環，小于膜孔徑的物質可以透過膜到透過端，而大于膜孔徑的物質會被膜截留，從而實現目標物質的濃縮以及不同物質的分級分離。中空纖維柱具有纖維管狀的開放式流道結構，無篩網的管狀流道結構避免了料液的無規則劇烈湍流，因此具有更低的剪切力，溫和的操作可以有效防止病毒表面糖蛋白的脫落和蛋白的聚集，同時有助于雜蛋白的透過和去除。

分子篩凝膠層析是一種多孔性的不帶表面電荷的物質，當帶有多種成分的樣品在凝膠內運動時，由于分子量不同在緩沖液洗脫時，分子量大的物質不能進入凝膠孔內，而在凝膠間幾乎是垂直的向下運動，而分子量小的物質則進入凝膠孔內進行繞道運行，這樣就可以按分子量的大小，先后流出凝膠柱，達到分離的目的。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，目的在于提供一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法。

為實現上述發明目的，本發明采用如下技術方案：

一種大規模生產高純度豬偽狂犬病毒的方法，包括如下步驟：

(1)取純懸浮BHK細胞培養的豬偽狂犬病毒培養液，連續流離心取上清作為待澄清樣品；

(2)將步驟(1)所得待澄清樣品利用中空纖維柱澄清過濾，得到病毒澄清液；

(3)將步驟(2)所得病毒澄清液利用中空纖維柱超濾濃縮，得到病毒濃縮液；

(4)將步驟(3)所得病毒濃縮液利用分子篩凝膠層析柱層析，收集洗脫后的第一個洗脫峰，所得洗脫液即為高純度的豬偽狂犬病毒。