[發明專利]一種OsGA3ox1基因在水稻雄性不育株系創制中的應用

有效

• 申請號: 201710531581.5
• 申請日: 2017-07-03
• 公開（公告）號: CN107227303B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 龍起樟;萬建林;黃永蘭;王會民;唐秀英;蘆明
• 申請（專利權）人: 江西省超級水稻研究發展中心
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;A01G7/06;A01H1/02;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 蘇州中合知識產權代理事務所(普通合伙) 32266
• 代理人: 伍兵

1.一種應用水稻OsGA3ox1基因創制水稻雄性不育株系的方法，其特征在于，所述的方法包含步驟：利用CRISPR/Cas9系統對普通水稻中的OsGA3ox1基因進行定點敲除，培育，獲得水稻雄性不育株系：

1)利用公開軟件CRISPR-P設計針對OsGA3ox1基因的sgRNA引導序列；

2)根據設計的sgRNA引導序列及載體構建要求，合成末端四個堿基外其余堿基反向互補的寡脫氧核糖核酸sgG3x1U3-F：ggcaCATCTGCTTCGGGTACCGG和sgG3x1U3-R：aaacCCGGTACCCGAAGCAGATG，以及sgG3x1U6-F：cttgACTCGTCGATGAGAGCTCT和sgG3x1U6-R：aaacAGAGCTCTCATCGACGAGT；

3)分別把反向互補寡脫氧核糖核酸退火成雙鏈寡核酸；

4)酶切、連接和轉化，分別把所得的雙鏈寡核酸連接到CRISPR/Cas9載體；

5)測序，選取正確克隆，擴大繁殖提取質粒，其中，測序前先挑單克隆，以如下引物對單克隆進行測序，

OsU3-F：GGCATGCATGGATCTTGGAGGAAT，檢測克隆正確性，啟動子為OsU3時用，

OsU6-F：TTGAGCGATTACAGGCGAAAGTG，檢測克隆正確性，啟動子為OsU6時用，

35S-F：TGACGCACAATCCCACTATCCTTC，35S正向引物，檢測載體完整性，

Cas9-R-1：TCGAGCCTGCGGGACTTAGAG，cas9 5′端引物，檢測載體完整性，

C126：TCGTGAAGAAGACCGAGGTT，cas9 3′端引物，檢測載體完整性；

6)轉化農桿菌；

7)轉化水稻愈傷組織，獲得T0代轉化子；

8)對T0代轉化子中OsGA3ox1基因的靶位點進行測序檢測，具體為，

提取轉化子DNA，分別利用G3x1U3-F：TCGCGCTGCCGGCGGACGAC和G3x1U3-R：GCGGATGGCAGGGGGAGGGAAGGT，以及G3x1U6-F：TCGATCCGCCATTGCTTGCAT和G3x1U6-R：CCGAGCGCCTTGAAGAACATGG組成的引物對對轉化子OsGA3ox1基因組DNA中的sgRNA引導序列進行擴增，將擴增片段克隆至T載體，轉化大腸桿菌，挑單克隆測序，每個片段至少測10個單克隆以上，至少獲得5個陽性克隆；

9)判定突變情況，具體為，

將測序結果與野生型序列進行比對，分析，結果存在四種可能，無突變，純合突變、雜合突變或雙等位基因突變；

10)觀察突變轉化子表型，判定OsGA3ox1基因敲除情況，具體為，

觀察T0代OsGA3ox1基因突變轉化子表型，包含花粉I2-KI染色情況，散粉情況，結實情況是否受影響；

根據花粉I2-KI染色判定OsGA3ox1基因是否敲除，若一轉化子中一半左右花粉I2-KI染色較正常花粉淺，則該突變轉化子中有一個等位基因完成OsGA3ox1基因敲除，若幾乎全部花粉染色都比正常花粉淺，則兩個OsGA3ox1等位基因都完成敲除，若染色與野生型無異，則突變并不影響基因功能；

11)按照10)確定的等位基因敲除類型選擇赤霉素噴施方案實施噴施，獲得水稻雄性不育株系。

2.一種通過權利要求1所述的方法創制的水稻雄性不育株系的育性恢復方法，其特征在于，所述的育性恢復方法為向所述水稻雄性不育株系穗部噴施赤霉素類物質的水溶液，所述赤霉素類物質為GA3，所述噴施的時期是在水稻孕穗期至揚花期，所述噴施的時間為早上6-9點或下午4-6點中的一種，所述噴施的次數為2～8次，所述噴施的赤霉素類物質的濃度為5～90mg/L。

3.根據權利要求2所述的水稻雄性不育株系的育性恢復方法，其特征在于，所述噴施的次數為3～5次，所述噴施的赤霉素類物質的濃度為20～40mg/L。

4.一種通過權利要求1所述的方法獲得的水稻雄性不育株系在水稻雜交種制種中的應用，其特征在于，在制種中，水稻雄性不育株系作為母本而種植。