[發明專利]一種具有γ-松油烯合成能力的基因工程菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201710531551.4
• 申請日: 2017-07-03
• 公開（公告）號: CN107354118B
• 公開（公告）日: 2020-12-18
• 發明（設計）人: 張海波;趙宏偉;咸漠;齊暢
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P5/00;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 鄧宇

1.一種具有γ-松油烯合成能力的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是在微生物中異源表達羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因mvaS、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE、甲羥戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羥戊酸激酶基因ERG8、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因ERG19、異戊烯基焦磷酸異構酶基因IDI1、香葉基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2得到的重組菌；所述γ-松油烯合成酶基因TPS2來源于百里香（Thymus vulgaris），GenBank序列登記號為KR920616；所述香葉基焦磷酸合成酶（GPPS2）來源于冷衫針茅（Abiesgrandis），GenBank序列登記號為AAN01134.1；所述羥甲基戊二酰輔酶A還原酶mvaE來源于糞腸球菌（Enterococcusfaecalis），GenBank序列登記號為AAG02439.1；所述甲羥戊酸激酶ERG12、磷酸甲羥戊酸激酶ERG8、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶ERG19和異戊烯基焦磷酸異構酶基因IDI1均來源于釀酒酵母（SaccharomycescerevisiaeATCC 4040002），GenBank序列登記號分別為:AJS99582.1、AJS99594.1、KZV08671.1、AJU24162.1，出發菌株為大腸埃希氏菌（E. coli）。

2.一種權利要求1所述的基因工程菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因mvaS、羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE、香葉基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2連接到商品質粒pACYC-Dute1，得到重組質粒；

2）以商品質粒pTrcHis2B和甲羥戊酸激酶基因ERG12、磷酸甲羥戊酸激酶基因ERG8、甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶基因ERG19和異戊烯基焦磷酸異構酶基因IDI1構建重組質粒pTrc-low；

3）將上述步驟得到的兩個重組質粒導入E. coli BL21（DE3）中，得到大腸桿菌基因工程菌。

3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）先將羥甲基戊二酰輔酶A合成酶基因mvaS和羥甲基戊二酰輔酶A還原酶基因mvaE以串連的方式連接到商品質粒pACYC-Dute1中，得到質粒pACYC-mvaS-mvaE，再分別將香葉基焦磷酸合成酶基因GPPS2和γ-松油烯合成酶基因TPS2連接到質粒pACYC-mvaS-mvaE中，得到重組質粒pACYC-mvaS-mvaE-GPPS2-TPS2，將其命名為pHW2；

2）以質粒pTrcHis2B和釀酒酵母S. cerevisiae ATCC 4040002的基因組為模板，擴增出質粒pTrcHis2B的部分片段，以及釀酒酵母MVA途徑的下游4個基因片段，然后以這些片段或pTrcHis2B骨架為模板，通過普通PCR或者重疊PCR擴增出組裝pTrc-low質粒的6個SFs片段SF128、SF819、SF19I、SFIB、SFB12、SFB，并將擴增的6個SFs片段以等摩爾比例在EP管中混勻，沸水浴使其變性，室溫自然冷卻，得到載體連接液；之后將載體連接液轉化大腸桿菌感受態細胞，37℃培養過夜后，進行菌落PCR，鑒定并得到重組質粒pTrc-low；

3）將上述步驟得到的兩個重組質粒導入E. coli BL21（DE3）中，得到大腸桿菌基因工程菌。

4.權利要求1所述的基因工程菌在生物合成γ-松油烯中的應用。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述基因工程菌是以甘油或葡萄糖為原料生物合成γ-松油烯的。