[發明專利]一種抗丁丙諾啡雜交瘤細胞株、抗體的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201710529576.0
• 申請日: 2017-07-02
• 公開（公告）號: CN108866006A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 鄭曙劍;朱佩佩;劉靜
• 申請（專利權）人: 杭州隆基生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K14/44
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 金杭

1.一種抗丁丙諾啡雜交瘤細胞株BUP 9X1,該細胞株保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO.C201728。

2.一種制備抗丁丙諾啡雜交瘤細胞株BUP 9X1的方法，其特征在于它包括以下步驟：

（1）以鹽酸丁丙諾啡為原料，游離后與溴戊酸乙酯進行親核取代反應，水解得到含羧基的丁丙諾啡半抗原，通過N，N-二環己基碳二亞胺將其連接于載體蛋白的氨基上，得到丁丙諾啡-KLH人工抗原；

（2）將丁丙諾啡-KLH人工抗原、弗氏佐劑、3%吐溫-80生理鹽水按1：1：1的體積通過攪拌法得到丁丙諾啡乳劑，用該乳劑免疫小鼠；

（3）小鼠頸斷處死，浸泡于75﹪酒精中消毒，約10min后，撕開小鼠腹外皮膚，暴露其腹膜，用注射器注入37℃預熱的DMEM無血清培養基，輕揉小鼠腹腔1-2分鐘，懸浮腹腔細胞，吸出腹腔液；剪開小鼠胸腔取胸腺研磨后收集懸液，與腹腔液合并離心，沉淀物用HAT完全培養液重懸，得到飼養細胞懸液；

把小鼠骨髓瘤細胞SP2/0用含10%FBS的DMEM培養基進行傳代培養；

取經上述免疫的BALB/c雌鼠處死，泡75%的酒精中消毒后剖腹，無菌取出脾臟，將脾臟放在連接著50ml離心管的不銹鋼濾網上，立即加入5ml無血清的DMEM培養液，用眼科剪剪碎脾臟，然后用無菌的注射器柄輕磨脾臟，使脾臟細胞經過網孔濾入離心管內，加無血清培養液至30ml，離心，棄上清用無血清培養液重復離心一次，待用；

采用聚乙二醇融合法，將脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0混合均勻，離心洗滌細胞，去除上清液，置于37℃水浴，加入0.7ml 37℃預溫的PEG 4000，一分鐘內加完，然后靜止90秒；

再加入25ml 37℃預溫的DMEM無血清培養液終止PEG作用；離心，取沉淀；然后在沉淀中加入飼養細胞懸液，接種到96孔細胞培養板中，置于37℃，5﹪CO₂培養箱中培養；

24小時后，采用HAT培養基，HAT選擇培養液維持培養兩周后，改用HT培養液，再維持培養兩周，改用一般培養液；

3-1：初篩：

融合細胞隔3天后換液一次，觀察96孔細胞培養板里的融合細胞生長情況，在細胞生長到細胞團簇（在16倍物鏡和10倍目鏡下觀察，細胞大小占滿1/3視野）時，吸取融合細胞培養上清液，采用間接ELISA方法篩選陽性克?。?/p>

3-2：復篩：

將篩選到的陽性克隆進一步用競爭抑制ELISA方法進行復篩，篩選出競爭抑制率最高的雜交瘤細胞株BUP 9X1做克隆培養；

3-3：雜交瘤細胞株BUP 9X1的克隆化：

雜交瘤細胞株BUP 9X1的克隆化培養按有限稀釋法進行，準確計數細胞，用含10﹪FBS的DMEM培養基稀釋成4個/ml的細胞懸液，然后以每孔200μl稀釋后的細胞懸液接種到96孔細胞培養板中，7天后觀察細胞生長情況并檢測細胞培養上清液的抗體水平，選擇3個效價最高的單克隆，做克隆化培養，直至單克隆孔抗體檢測陽性率多次達到100﹪；得到一株能穩定分泌專一性抗體的的抗丁丙諾啡單克隆細胞。

3.根據權利要求2所述的一種制備抗丁丙諾啡雜交瘤細胞株BUP 9X1的方法，其特征在于步驟(1)中，丁丙諾啡人工抗原的制備：